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上海远慕生物科技有限公司
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质粒提取师弟师妹不懂的背后原理是什么?
人阅读 发布时间:2019-02-26 16:51
说起提取质粒,想必是做分子生物学的搬砖工们每天的常规工作。随着各大公司开发出各种质粒提取 kit,为苦逼的生物狗带来了福音—试剂再也不用自己配了,提取步骤再也不用那么繁琐了。
但,你先别着急高兴,久而久之,很多刚进实验室的小白师弟师妹再也不懂得背后的原理:质粒提取出来掺杂有蛋白或者基因组 DNA 怎么办?待转染或酶切的质粒被有机溶剂污染了怎么办?且听我一一道来。
质粒是独立于基因组外的小型环状 DNA 分子,能够自我复制,在分子克隆中是最常用的外源基因载体。在自然状态下,质粒常存在于细菌中,携带对宿主在某些特殊情况下的抗性基因,例如抗生素抗性基因。
举个栗子,如图所示,这是质粒 pBR322 的示意图,第一个被广泛用作基因载体的质粒。不仅能够独立自主复制(ori),而且在多克隆位点(Multiple cloning sites)处可以插入想要表达的目的基因,将插入目的基因的质粒转化到细菌或真核细胞中,在合适的条件下目的基因便可得到表达。
为了方便验证转化是否成功,质粒上还带有筛选标记——抗性基因,在质粒 pBR322 中是 amp 和 tet 抗性。在转化后,向培养基中加入 amp 或 tet,能够生长的菌株就是成功转化的。