1.什么是RIPA裂解液？

RIPA裂解液（Radio Immunoprecipitation Assay Lysis buffer，放射免疫沉淀法裂解缓冲液）是一种传统的可用于裂解细胞或组织的快速裂解液，其原理为利用表面活性剂等裂解细胞膜（包括核膜），从组织或细胞中抽取可溶性蛋白。RIPA裂解液裂解后得到的蛋白一般可直接用于常规的WB、IP、co-IP等实验。

2.RIPA裂解液里有什么？

RIPA裂解液的配制方法有很多种，主要包括裂解成分、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂三种组分。裂解成分可通过破坏细胞膜和蛋白间的相互作用等方式裂解组织或细胞；蛋白酶抑制剂可有效抑制各类蛋白酶的活性，避免蛋白过度降解；磷酸酶抑制剂可有效抑制去磷酸化作用。

值得注意的是，由于RIPA裂解液中含有一些稳定性相对较弱的酶类抑制剂，故应放在-20℃保存。其中PMSF的稳定性极弱，半衰期只有0.5 h，所以必须现配现用。

3.如何选择合适的RIPA裂解液？

如果您只是要做普通的WB、IP或者co-IP，我们建议您使用免疫印迹及免疫沉淀用（WB/IP）裂解液(20118)，该裂解液在裂解细胞或组织后一般不会形成粘滞的透明状DNA团块，不必采用超声处理就可进行下一步操作。同时，该裂解液还适用于磷酸化蛋白的WB检测。

如果使用免疫印迹及免疫沉淀用（WB/IP）裂解液(20118)的效果不是很好，那您的蛋白可能比较特殊，我们建议您可以尝试另外几种裂解液。如果您的蛋白是难溶性的蛋白，建议您可以尝试使用裂解强度更高的裂解液，如RIPA裂解液(强/中)；如果您在做IP实验的时候发现背景很高，即有很多非特异性蛋白被IP下来，这时候您需使用裂解强度较强的裂解液，比如RIPA裂解液(强/中)。反之，如果您发现目的蛋白无法IP下来，则说明您使用的裂解液强度过强，此时需使用裂解强度较弱的裂解液，比如RIPA裂解液(弱)。

4. RIPA裂解液适用于哪些细胞？

几乎适用于所有实验室培养的动物细胞和各种组织。包括各种悬浮细胞、贴壁细胞及动物组织等。

5. 如何判断细胞的裂解程度？

细胞裂解：加入RIPA后，充分裂解的细胞，没有细胞沉淀，很粘稠。如果像浑浊的水一样粘性很小则可能是裂解液得量加太多导致的；相反，如果RIPA裂解液后出现胶状物体，离心不能沉淀则可能是蛋白太多，RIPA裂解液加入的量太少导致的。

组织裂解：先将组织剪成细小的碎片，之后利用匀浆器或超声破碎的方法，镜检显示细胞破碎率大于90%，同时组织已经完全裂解，没有明显的小组织块。之后按照细胞裂解的步骤进行裂解，裂解程度的判断标准与细胞裂解一致。

RIPA裂解液的裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。在不检测和基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下，可以直接离心取上清进行后续实验；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则需通过超声处理打碎打散该透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验。如果检测一些常见的转录因子，如NF-κB、p53等时，通常不必进行超声处理，就可以检测到这些转录因子。

6. RIPA储存出现白色沉淀，为什么？

一般是由于裂解液中SDS在储存的时候沉淀析出导致，这时只需将裂解液放置于37℃水浴加热后恢复室温即可使用。

7. RIPA裂解液可以获得细胞中的不同蛋白吗？

RIPA裂解液提取的是全蛋白，包括核蛋白、浆蛋白、膜蛋白等。如果要提取特定的蛋白（如：核蛋白、膜蛋白）则可利用专门提这类蛋白的试剂盒进行提取。

远慕在这里给出的建议仅供大家参考，具体裂解液的选择和使用，还需要根据您自己的实验需求和实验效果选择适合您实验的RIPA裂解液。

8.RIPA裂解液的使用方法

如发现RIPA有沉淀，请放室温半小时或者常温水浴使沉淀溶解。

根据使用量，取每1ml RIPA 加入10ul PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。混匀备用 （PMSF现用现加）。

1.样品前处理：

a)对于贴壁细胞：去除培养液，用 PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。按照 6 孔板每孔细胞量加入150-250 ul裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。

b)对于悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。按照 6 孔板每孔细胞量加入 150-250 ul 裂解液的比例加入裂解液，再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成50-100万细胞/管，然后再裂解。

c)对于组织样品： 把组织剪切成细小的碎片。按照每20mg组织加入150-250 ul裂解液的比例加入裂解液。 (如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量)。用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。

2.后处理：

将裂解后的样品10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

注意事项 ：

强烈型裂解液，可以提取核蛋白，但在提取核蛋白的同时，也会将基因组一并释放出来，造成细胞裂解液粘稠，此时可以直接加入蛋白上样缓冲液，煮沸再离心，离心后直接上样电泳；若想测定浓度，可入加少量 SDS（1%），煮沸后离心测浓度。本系列蛋白提取试剂所提取的蛋白由于含有去污剂，所以不适合使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒，请选择BCA法或者Lowry法检测蛋白浓度。