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昆虫细胞的保存培养实验介绍

人阅读 发布时间:2023-03-20 10:53

实验材料 昆虫

试剂、试剂盒 胎牛血清 台盼蓝 乙醇

仪器、耗材 培养瓶 培养箱

细胞计数器 搅拌台 转子 离心机

实验步骤

1.  将4 ml 含10%胎牛血清的完全昆虫细胞培养基加入一个25 cm2 培养瓶。取出一支冻存Sf9细胞的安瓿,迅速置于37℃水浴,用手前后剧烈摇动融化之,当安瓿的内容物几乎完全融化时,将安瓿浸入70%乙醇,消毒外壁。

2.  打碎安瓿颈部,将内容物转移至25 cm2 培养瓶,用手轻轻摇动培养瓶,使细胞分散均匀,于27℃温育2~3 h 直到细胞贴壁。

3.  除去旧培养液,换5 ml 含10%胎牛血清的新鲜完全培养液。继续温育,每3天换液一次,直到细胞生长汇片。

4.  准备一个新的25 cm2 培养瓶,加入4 ml 含10%胎牛血清的完全培养液

5.  当Sf9细胞已生长汇片时,弃去培养瓶中的培养液。加入新鲜的完全培养液,用移液管轻柔吹打或用手掌轻拍培养瓶,重悬细胞。

6.  用为培养组织细胞所设计的血细胞计数器计数细胞,在25 cm2 培养瓶中接种1×106~2×106个细胞,摇动培养瓶使细胞均匀分布。于27℃温育,每3天用含10%FBS的完全培养基换液,直到培养瓶中的细胞生长汇片。

7.  弃去汇片的单层培养细胞中的培养液,并重悬细胞。

8.  用血细胞计数器计数细胞。以约4×105~5×105细胞/ml 的密度将细胞接种于一个旋转培养瓶中。于27℃温育,以60~80 r/min 的速度恒速搅拌。轻微开启旁边的通气孔,以保证充足的空气。

9.  每隔2~3天进行细胞计数,当细胞密度达到2×106~2×106细胞/ml 时进行传代, 将适量细胞移至一个含有新鲜完全培养液的新培养瓶中,使终密度达到4×105~5×105细胞/ml。或者,倒出适当体枳的细胞悬液,代之以新鲜培养液。

10.  加入0.1 ml 的0.4%台盼蓝于1 ml 对数生长的细胞中,确定细胞活力。在低倍显微镜下检査细胞,计数被台盼蓝染色的细胞(死细胞),并计算总细胞数。

11.  将细胞传代至1份完全培养液/10%胎牛血请清和1份无血清培养液混合的液体中。让细胞长至汇片(单层培养),或达到2×106~3×106细胞/ml 的密度(悬浮培养)。

12.  将细胞传代至含胎牛血清完全培养液与无血清培养液比例为1:4的混合液中,让细胞生长。

13.  用完全培养液与无血清培养液比例为1:8至1:10的混合液,重复细胞传代与细胞生长的步骤。

14.  用无血清培养液传代细胞。

15.  计数呈指数生长的待冻存细胞,于室温以1 000g 离心10 min,弃去上清液。

16.  用含10%胎牛血清的完全培养液以1×107~2×107细胞/ml 的密度重悬细胞团块。 加入等体积含10%胎牛血清和20%DMSO的完全培养液,将细胞置于冰浴。吸出 1 ml 细胞移入带螺口盖的冻存管中,于-20℃保存2 h,然后于-70℃过夜。

17.  将冻结的细胞移至液氮罐中以便长期保存。
 

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