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上海远慕生物科技有限公司
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植物体内脱落酸、赤霉素的分离和测定
人阅读 发布时间：2020-07-23 10:10
在研究植物生命活动过程中，常常需要准确了解某一激素的含量以及各激素间的比例。因此，植物内源激素的提取分离和测定是植物生理学实验技术中极其重要的内容。本实验以ABA和GA为例，介绍激素的提取、分离及测定的基本原理和方法。
一、原理
利用脱落酸（abscisic acid，ABA）和赤霉素（gibberellic acid，GA）能溶解于有机溶剂（如丙-酮、甲醇）的特性进行提取，将粗提物经过一系列的分离技术（如萃取、薄层层析或纸层析等），使ABA、GA与其它成分分离。再对纯化的ABA和GA进行生物学鉴定或物理化学鉴定。
（一）生物鉴定1.ABA能抑制植物器官的生长，在一定的浓度条件下，其抑制程度与浓度呈线性关系。利用这一线性关系就可确定组织中ABA的含量。2.GA能刺激幼嫩植物的节间伸长，特别是矮生植物的茎。在一定浓度范围内，茎的伸长度与GA浓度呈线性关系。因此，根据茎的伸长度就可确定GA的含量。
（二）物理化学鉴定：可采用气相色谱法。
二、材料、仪器设备及试剂
（一）材料：植物叶片、水稻种子及幼苗等；
（二）仪器设备：1.气相色谱仪；2.分液漏斗；3.组织匀浆器；4.旋转蒸发干燥器；5.层析缸；6.华特曼-3号层析纸；7.微量注射器。
（三）试剂：1. 100％甲醇；2. 80％甲醇；3. 石油-醚；4. 乙酸-乙酯；5. 1mol/LHCl；6. 硅酸GF232；7. 氯-仿；8. GA；9. ABA；10. 乙醇；11. 正丁-醇；12. 异-丙醇；13. 3mol/L氨-水。
三、实验步骤与结果计算
（一）脱落酸和赤霉素的提取和分离
1.样品提取（1）取新鲜材料或贮存材料（用100％甲醇固定，放置-10℃冰箱中至待测时）10g，剪碎，加入60ml预冷（＜0℃＝的80％甲醇溶液，匀浆5min，匀浆液在4℃下振荡（或搅拌）24h，过滤。残渣再用20ml甲醇液振荡1h。反复二次，滤液混合。（2）将滤液在旋转蒸发器上干燥减压蒸发（36～38℃）至原体积一半，再加入10ml石油-醚提取部分色素，将下层甲醇液取出，弃掉石油-醚层，继续减质浓缩至水溶液。在此水溶液中含有IAA、ABA、GA和CTK等。
2.样品萃取将水溶液用1mol/LHCl调pH至2.8～2.5左右。并以与水溶液等体积的乙酸-乙酯萃取。将混合溶液装入分液漏斗，分离水相和乙酸-乙酯相。取水相再用乙酸-乙酯萃取2次。合并乙酸-乙酯溶液。此时，CTK（细胞分裂素）存在于水相中，而ABA、GA、IAA存在于乙酸-乙酯中。
3.样品的纯化（1）将乙酸-乙酯溶液用旋转蒸发器浓缩至干。用2ml100％甲醇溶解残留物。（2）点样：取100μl甲醇溶液点在涂有硅胶GF254玻板下端1cm处（或点在华特曼3号层析纸上），并在同一水平上分别点上标准GA和ABA溶液100μl。（3）展层：用异丙-醇-28％氨-水-水（10∶1∶1，V／V／V）作为展层剂展层。前沿至玻板顶端0.5cm处即停止展层。（4）定位：层析完毕后，吹干玻板并在紫外灯下观察色带，与标准ABA和GARf值相同或相近的色带，就作为纯化后的ABA和GA。（5）洗脱：将ABA和GA带分别括下（或剪下），用95％乙醇浸提3次。溶液经减压蒸干后，即可进一步作生物学测定或气相色谱测定之用。
（二）ABA和GA的测定
1.ABA的生物学鉴定
（1）材料培养：精选小麦种子，25℃黑暗下浸种2h，排于培养皿湿滤纸上，在25℃下发芽。待胚根出现后，移入培养缸中的塑料网上，继续在25℃暗中培养。约72h后，选取胚芽鞘2.8～3.0cm的幼苗，用刀片自顶端分别切成3mm，5mm，5mm三小段，取中间5mm切段置蒸馏水中2～3h，备用。
（2）ABA母液（200μg/ml）的配制：称取20mgABA，溶于少量酒精，以无离子水定容至100ml。
（3）标准溶液的配制：吸取5ml母液，加无离子水定容至100ml，即为10μg/ml。吸取5ml10μg/mlABA溶液，用2％蔗糖-0.01mol/L磷酸缓冲液（pH5.0）定容至50ml，即为1μg/mlABA标准液。余此类推，分别配成0、0.001、0.01、0.1、1μg/ml标准液。
（4）标准曲线的绘制：取2ml各种浓度的ABA标准液分别置入10ml具塞试管，每管加入小麦芽鞘切段10根。各浓度均需3～4个重复。加塞后，置暗处25℃摇床上振荡20h。将10个切段取出测定其总长度（cm），然后按下列公式计算处理后减少的百分数（R）：R（％）＝(D空-D处理)/D原×100。
式中：D空：空白总长度；D处理：处理总长度；D原：原始总长度（5.0cm）。用R与ABA浓度的相关性，绘制标准曲线。
（5）将待测样品溶于2ml2％蔗糖-0.01mol/L磷酸缓冲液（pH5.0），置具塞试中，按上述步骤操作，算出R值，再查标准曲线，就得到ABA浓度C，依下式计算出样品中ABA含量：ABA含量（μg/g鲜重）＝C（μg/ml×2×10-1/W（g）2.ABA的气相色谱测定将洗脱的ABA加入0.1mlBSA（N.O-二-三甲基硅-烷基乙酰胺）使脱落酸硅-烷化。0.5h后，吸取5μl作气相层析，层析条件：柱长2m，φ5mm（不锈钢柱）、固定相为10％SE-30，DMCS、A、W为担体，进样口温度250℃，柱温200℃，FID检测。载气流速为30μl/min，采用内标法定性，外标法定量。计算：ABA含量（μg/g鲜重）＝A1×Ws×100×1/(As×5×W)
一、原理
利用脱落酸（abscisic acid，ABA）和赤霉素（gibberellic acid，GA）能溶解于有机溶剂（如丙-酮、甲醇）的特性进行提取，将粗提物经过一系列的分离技术（如萃取、薄层层析或纸层析等），使ABA、GA与其它成分分离。再对纯化的ABA和GA进行生物学鉴定或物理化学鉴定。
（一）生物鉴定1.ABA能抑制植物器官的生长，在一定的浓度条件下，其抑制程度与浓度呈线性关系。利用这一线性关系就可确定组织中ABA的含量。2.GA能刺激幼嫩植物的节间伸长，特别是矮生植物的茎。在一定浓度范围内，茎的伸长度与GA浓度呈线性关系。因此，根据茎的伸长度就可确定GA的含量。
（二）物理化学鉴定：可采用气相色谱法。
二、材料、仪器设备及试剂
（一）材料：植物叶片、水稻种子及幼苗等；
（二）仪器设备：1.气相色谱仪；2.分液漏斗；3.组织匀浆器；4.旋转蒸发干燥器；5.层析缸；6.华特曼-3号层析纸；7.微量注射器。
（三）试剂：1. 100％甲醇；2. 80％甲醇；3. 石油-醚；4. 乙酸-乙酯；5. 1mol/LHCl；6. 硅酸GF232；7. 氯-仿；8. GA；9. ABA；10. 乙醇；11. 正丁-醇；12. 异-丙醇；13. 3mol/L氨-水。
三、实验步骤与结果计算
（一）脱落酸和赤霉素的提取和分离
1.样品提取（1）取新鲜材料或贮存材料（用100％甲醇固定，放置-10℃冰箱中至待测时）10g，剪碎，加入60ml预冷（＜0℃＝的80％甲醇溶液，匀浆5min，匀浆液在4℃下振荡（或搅拌）24h，过滤。残渣再用20ml甲醇液振荡1h。反复二次，滤液混合。（2）将滤液在旋转蒸发器上干燥减压蒸发（36～38℃）至原体积一半，再加入10ml石油-醚提取部分色素，将下层甲醇液取出，弃掉石油-醚层，继续减质浓缩至水溶液。在此水溶液中含有IAA、ABA、GA和CTK等。
2.样品萃取将水溶液用1mol/LHCl调pH至2.8～2.5左右。并以与水溶液等体积的乙酸-乙酯萃取。将混合溶液装入分液漏斗，分离水相和乙酸-乙酯相。取水相再用乙酸-乙酯萃取2次。合并乙酸-乙酯溶液。此时，CTK（细胞分裂素）存在于水相中，而ABA、GA、IAA存在于乙酸-乙酯中。
3.样品的纯化（1）将乙酸-乙酯溶液用旋转蒸发器浓缩至干。用2ml100％甲醇溶解残留物。（2）点样：取100μl甲醇溶液点在涂有硅胶GF254玻板下端1cm处（或点在华特曼3号层析纸上），并在同一水平上分别点上标准GA和ABA溶液100μl。（3）展层：用异丙-醇-28％氨-水-水（10∶1∶1，V／V／V）作为展层剂展层。前沿至玻板顶端0.5cm处即停止展层。（4）定位：层析完毕后，吹干玻板并在紫外灯下观察色带，与标准ABA和GARf值相同或相近的色带，就作为纯化后的ABA和GA。（5）洗脱：将ABA和GA带分别括下（或剪下），用95％乙醇浸提3次。溶液经减压蒸干后，即可进一步作生物学测定或气相色谱测定之用。
（二）ABA和GA的测定
1.ABA的生物学鉴定
（1）材料培养：精选小麦种子，25℃黑暗下浸种2h，排于培养皿湿滤纸上，在25℃下发芽。待胚根出现后，移入培养缸中的塑料网上，继续在25℃暗中培养。约72h后，选取胚芽鞘2.8～3.0cm的幼苗，用刀片自顶端分别切成3mm，5mm，5mm三小段，取中间5mm切段置蒸馏水中2～3h，备用。
（2）ABA母液（200μg/ml）的配制：称取20mgABA，溶于少量酒精，以无离子水定容至100ml。
（3）标准溶液的配制：吸取5ml母液，加无离子水定容至100ml，即为10μg/ml。吸取5ml10μg/mlABA溶液，用2％蔗糖-0.01mol/L磷酸缓冲液（pH5.0）定容至50ml，即为1μg/mlABA标准液。余此类推，分别配成0、0.001、0.01、0.1、1μg/ml标准液。
（4）标准曲线的绘制：取2ml各种浓度的ABA标准液分别置入10ml具塞试管，每管加入小麦芽鞘切段10根。各浓度均需3～4个重复。加塞后，置暗处25℃摇床上振荡20h。将10个切段取出测定其总长度（cm），然后按下列公式计算处理后减少的百分数（R）：R（％）＝(D空-D处理)/D原×100。
式中：D空：空白总长度；D处理：处理总长度；D原：原始总长度（5.0cm）。用R与ABA浓度的相关性，绘制标准曲线。
（5）将待测样品溶于2ml2％蔗糖-0.01mol/L磷酸缓冲液（pH5.0），置具塞试中，按上述步骤操作，算出R值，再查标准曲线，就得到ABA浓度C，依下式计算出样品中ABA含量：ABA含量（μg/g鲜重）＝C（μg/ml×2×10-1/W（g）2.ABA的气相色谱测定将洗脱的ABA加入0.1mlBSA（N.O-二-三甲基硅-烷基乙酰胺）使脱落酸硅-烷化。0.5h后，吸取5μl作气相层析，层析条件：柱长2m，φ5mm（不锈钢柱）、固定相为10％SE-30，DMCS、A、W为担体，进样口温度250℃，柱温200℃，FID检测。载气流速为30μl/min，采用内标法定性，外标法定量。计算：ABA含量（μg/g鲜重）＝A1×Ws×100×1/(As×5×W)
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