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远慕生物简述重组人蛋白细胞因子

人阅读 发布时间:2019-09-23 13:45

1.重组蛋白表达体系
     MCE 重组蛋白表达体系主要有:大肠杆菌,酵母细胞,昆虫细胞和哺乳动物细胞。
 
2.重组蛋白纯度和浓度测定
重组蛋白纯度测定方法:a. SDS-PAGE 测定法;b. HPLC 测定法;c. 银染测定法。
重组蛋白浓度测定方法:a. Bradford 蛋白定量测定法;b. BCA 蛋白定量测定法;c. SDS-PAGE 蛋白定量测定法。
 
3.重组蛋白表达体系对比      
表达体系    优缺点
原核体系    繁殖快、成本低,产量高,但不能进行糖基化修饰,常为包涵体
哺乳动物细胞    结构与天然蛋白最接近,完善的翻译后加工,活性更好,但表达水平较低,周期长,技术要求高
酵母细胞    易操作,蛋白背景弱,适合大规模生产,便于纯化,但存在产量不高以及糖基化达不到要求等问题
昆虫细胞    功能与天然蛋白相似,对于部分有毒性或较难表达蛋白有优势,但糖基化程度低,形式比较单一,活性不如哺乳动物细胞表达系统  
 
4.重组蛋白表达体系选择

研究目的    蛋白要求    最适表达系统
用作抗原,获得特异性抗体    纯度>80%,不需要蛋白修饰或天然活性,可带标签    原核表达体系
用于检测蛋白质结晶及晶体结构研究    纯度>95%,浓度通常在 10 mg/mL    2/3 是原核表达体系,1/3 是昆虫细胞表达体系与哺乳动物细胞表达体系
蛋白的功能研究    需要保存蛋白的天然活性    原核表达体系和真核表达体系
用于药物研究的蛋白质    一般要求尽量保存天然序列,具有天然活性    真核表达体系  

5.重组蛋白开盖使用前处理
为防止冻干粉产品的粉末沾在管壁或管盖上,使用前请勿开盖,离心(约13000 rpm)处理 20-30 秒,使附于管盖或管壁的蛋白收集于管底。MCE 保证每管产品的蛋白总量达到标示含量。
 
6.重组蛋白复溶
a. 使用前先离心(约 13000 rpm)处理 20-30 秒,使附于管盖或管壁的蛋白收集于管底。
b. 严格依据说明书,使用推荐的溶液将蛋白冻干粉溶解至推荐的浓度。大多数重组蛋白建议溶解在灭菌超纯水中,浓度不低于 100 μg/mL,以便于后续进一步稀释至工作浓度。
c. 用移液枪轻吹混匀,或将管盖盖好后轻柔颠倒数次进行混匀,低速离心数秒。
d. 复溶后的重组蛋白在室温放置数分钟,以保证蛋白能够充分溶解。
 
7.重组蛋白储存
由于每次冻融都会造成蛋白的部分变性,因此建议客户收到产品后适量分装避免反复冻融。
a. 短期储存:
冻干粉状态产品在室温下存放 3 周,不影响活性。复溶后的产品在 4℃ 可稳定储存 1-2 周。
b. 长期储存:
冻干粉状态产品在 -20℃ 下,可稳定保存至少一年;推荐 -80℃ 长期保存,以获得更稳定性能的产品。可选择包含一定浓度载体蛋白(0.1% BSA, 5% HSA, 10% FBS,或 5% 海藻糖)的溶液或培养基复溶产品,分装后冻存于 -20℃ 下,可保存至少三个月;推荐 -80℃ 长期保存,以获得更稳定性能的产品。
注:分装冻存时,蛋白浓度不低于 100 ng/μL,且每管的体积不可小于 20μL。
 
8.重组蛋白标签影响
蛋白标签指重组蛋白制备过程中与目的蛋白融合表达的蛋白或多肽。MCE的重组蛋白产品大部分为无标签状态,但少数重组蛋白产品因为不同目的需要加有标签。
a. 标签利于蛋白纯化。
b. 当目的蛋白无特定抗体直接鉴定,可利用标签进行 Western Blot 或ELISA 分析方法鉴定。
c. Fc 标签可以提升重组蛋白的半衰期以提高分子的稳定性,同时也能够促进重组蛋白形成活性二聚体。重组蛋白标签对蛋白的生物学活性影响存在未知结论,但对大部分检测应用中,重组蛋白的标签对蛋白本身生物学活性并无影响,所以无需移除。MCE 对重组蛋白产品都已经做过生物学活性检测并将数据公示于 COA 中。
 
9. 重组蛋白活力值与计算方法
MCE 重组蛋白的生物学活性 (ED50) 测定数据在 COA 中可以获得。ED50 是Effective Dose 50 的缩写,是可诱导 50% 最大反应的蛋白浓度 (ng/mL)。

10. 重组蛋白 ED50 值的批间差
不同批次的产品或不同实验方法的测定都会导致重组蛋白产品的 ED50 值变化,我们推荐客户根据自己的实验测定得到最合适的实际 ED50 值。
 
11. 重组蛋白应用方案
MCE 重组蛋白产品的 COA 中显示的实验方案只是确认该产品的 ED50 值,但并不与终端客户的不同类型实验结果存在等效性。如果客户需要应用在不同于本公司产品测试的实验方法时,我们建议客户通过实际测试获得最佳 ED50 值。
 
12.重组蛋白的种属交叉活性
重组蛋白的种属交叉活性需要根据具体产品而定;建议尽量选择对应种属的重组蛋白。如实在无法匹配种属,以下信息供参考:
a. 大多数人细胞因子对小鼠细胞有效 (仅少数例外)。
b. 多数小鼠细胞因子对人细胞有效,但特异性可能不强。如小鼠的表皮生长因子(EGF)对人的表皮细胞有活性,对人的其他种类细胞可能也有作用。
c. 干扰素、GM-CSF、IL-3、IL-4 具有种属特异性,即重组人的这些细胞因子只能作用于人细胞,对小鼠和大鼠等其他种而重组小鼠的这些细胞因子也仅用于小鼠,对人的细胞无效。
d. 成纤维细胞生长因子 (FGFs)、神经营养素 ( Neurotrophins,如 BDNGF、GDNF、CNTF、β-NGF 等)、TGF-β 等高度保守,各种属间交叉活性强。
 

 

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