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胰酶分离提取,进口胎牛血清提取制备酶的经典方法

人阅读 发布时间:2019-08-16 11:30

  进口胎牛血清提取制备酶的经典方法,多采用硫酸铵分级沉淀,胰酶在75%饱和度硫酸铵中沉淀,其它杂蛋白一般在10%硫酸铵饱和度下被沉淀而除去。经此多次提取,后在PH8.0peng酸缓冲液中得到结晶。
本实验拟通过从猪胰脏中制备胰酶结晶实验,掌握酶的制备、一般分离、提取、纯化和结晶的操作技术。同时为亲和层析、免疫学实验准备实验样品。

1、胰蛋白酶原的提取与分离:称取1-1.5Kg新鲜猪胰脏,在冰浴下剥除脂肪和结缔组织,在低温下用绞肉机绞碎胰脏(或用高速组织匀浆机捣碎)加1-2倍体积以预冷却的PH2.5-3.0乙酸酸化水溶液提取(按1g组织相当于1ml体积计算,以此类推)。检查提取液中PH,若高于PH3.0时应及时用10%乙酸调节,使提取液维持PH2.5-3.0之间。在冷室5℃左右搅拌提取18-24h,而后用4层纱布过滤,尽量拧挤出滤液,滤液呈乳白色,用约300mlpH2.5乙酸酸化水再提取残渣一次(时间约为1-2h),合并滤液,此时滤液PH值较高,可用5M H2PO4溶液调整PH至2.5-3.0,放置 3-5h后,浑浊滤液冷却后,用玻璃漏斗进行自然过滤,滤液呈黄色透明液体,收集滤液,量其总体积,弃去沉淀物。

2、盐析:滤液加固体粉状硫酸铵进行盐析,使溶液至75%饱和度。盐析溶液放冷室中过夜,次日用4000r/min离心机离心,或用布氏漏斗抽滤,滤饼经压干后称重,可得约20g胰蛋白酶原粗制品。

3、胰蛋白酶原得激活:将胰蛋白酶原粗制品用10倍体积得冷蒸馏水,分多次加入使滤饼溶解,溶液呈乳白色,量其体积,取出1ml溶液用于测定,溶液中硫酸铵得含量(约为滤饼重得1/4)。因为硫酸铵可以与活化剂钙离子结合,生成硫酸钙,如果钙离子过少会直接影响胰酶原的激活过程,按浓度量计算,将已研细的固体CaCL2慢慢加入酶原溶液中,边加边搅拌均匀。用5MNaOH溶液调PH至8.0。在酶溶液加入约5mg结晶猪胰蛋白酶,轻轻搅拌均匀,置5℃冰箱中使酶原活化。

4、纯化:去除杂蛋白,量取胰蛋白酶溶液体积后,用5M硫酸溶液调节滤液PH至2.5-3.0,抽滤除去硫酸钙沉淀,滤液体积约1000ml,加入已经研细的硫酸铵粉末,使其溶液达40%饱和度(每升滤液加242g硫酸铵)。放置5℃冰箱中5-8h,抽滤除去沉淀。

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