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ELISA试剂盒基因工程试剂对免疫测定技术的影响

人阅读 发布时间:2019-07-18 11:49

   免疫测定技术的基础在于抗原抗体之间的特异结合反应,所以任何的诊断试剂离不开的原料,如抗原抗体,酶等。以前用于免疫测定的抗原通常为各种纯化抗原,而抗体则为纯化抗原免疫动物后获得的多克隆抗体和使用杂交瘤技术得到的单克隆抗体,而抗原或抗体的标记物如酶标结合物则通过各种化学合成方法制备。近年来,随着分子生物学的发展,使用基因工程方法制备各种特殊的抗原或抗体及其酶结合物等免疫测定试剂几成为现实的新一代试剂,各种新型使用的测定方法也不断出现。   

   HBsAg试剂特点(检测模式:临床抗体夹心法):包被抗体为山羊多抗。多抗具有高亲和性和对抗原各种表位的反应性。酶表抗体为与HBsAg有不同结合位点的鼠复合单位,可测得HBsAg变异样品,提高检测的特异性(99.98%)提高检测的灵敏度,应用Parl Ehrich 学说(PEI)HBsAg标准品,对ad标准品的灵敏度为0.05ng/ml对ay标准品灵敏度为0.025ng/ml

 

  众所周知,免疫测定的基础在于抗原抗体之间的特异结合反应。以前,用于免疫测定的抗原通常为各种纯化抗原,而抗体则为纯化抗原免疫动物后所获得的多克隆抗体和使用杂交瘤技术得到的单克隆抗体,而抗原或抗体的标记物如酶标结合物则通过各种化学合成方法制备。近年来,随着分子生物学技术的发展,使用基因工程方法制备各种特殊的抗原或抗体及其酶结合物等免疫测定试剂已成为现实,各种新型实用的测定方法不断出现。
    1.基因工程抗原  较早用于免疫测定的基因工程抗原是乙型肝炎病毒核心抗原(HB—:Ag)和乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg),这两种基因工程抗原的出现,较好地解决了抗HBc和吭HBe的测定问题,因为要从病毒本身去大量获取这两种纯抗原是较为困难的,并且这一点对于难于培养的病原微生物来说,具有共性。如乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)、丙型旰炎病毒(hepatitisCvirus,HCV)和梅毒螺旋体等。
    zui早在HIV抗体免疫测定中所使用的HIV抗原为用去垢剂裂解HIV感染的细胞后所提取的病毒抗原,这样得到的抗原纯度相对较差,因此,影响测定的特异性和敏感性。现在国内外用于HIV抗体检测的酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)均使用基因工程抗原如gp41,gpl20,gpl60等,大大提高了测定的特异性和敏感性。
    HCV目前尚不能体外培养,只能用基因工程或化学合成的方法获得HCV结构区和非结陶区的各种抗原片段,已知HCV基因组由7个功能区组成:核心,E1,E2/NSl,NSz,NSa,NS4和NSs区。合成肽抗原的优点是易于纯化,特异性好,但由于其片段短,分子量小,可能会缺乏立体构型决定簇,而基因工程抗原覆盖抗原位点多,抗原抗体反应强。*代抗HCV ELISA试剂盒所使用的HCV抗原为在酵母中表达的Qoo-a抗原,其为克隆的HCV几个片段与过氧化物歧化酶(SOD)基因融合后的产物,测定的特异性和灵敏度均较差.第二代试剂则主要以病毒核心区(C2。)及NSa区抗原(Caac)为主,亦有NS4区(C5…1+和Cio。)抗原,C22和C,ac早期检测能力及灵敏度和特异性方面均优于Qoo-a抗原。第三代试剂比第二代试剂更灵敏,更特异。适当降低了易产生非特异交叉反应的C::抗原的比例,相应增加了C3ac的比例;此外,还增加了NS5区抗原。zui近,美国Chiron公司Chien等研制了一种包括HCV基因组7个功能区所有免疫决定基的单一融合蛋白,称为多决定基融合抗原—6(mutiple-epitopefusionantigen,ME—FA-6),使用该融合蛋白建立的化学发光免疫测定方法,其测定敏感性较使用由NSa—NS4—核心(C2,)区组成的融合蛋白所建立的酶免疫测定方法要高2—4倍。
    临床上zui常用的梅毒抗体血清学试验是快速血浆反应素环状卡片试验(rapidplasmarea—gindrciecardtest,RPR).RPR是以牛心磷脂作为抗原,测定的是梅毒非特异性抗体。而验证试验——螺旋体血球凝集试验(treponemalpallidumhemagglutinationassay,TPHA)则使用梅毒螺旋体裂解抗原。凝集反应试验一般测定的灵敏度较差,但由于病原体裂解抗原纯度较差,难于建立特异性和灵敏度均好的ELISA方法。因此,近年来,不少研究者采用基因工程技术重组表达了梅毒螺旋体的具有高度免疫原性的膜脂蛋白TpNl7,TpN44.5(TmpA)和TpN47等,用其建立梅毒抗体检测的ELISA方法,表现了很好的测定特异性和敏感性,将已成为取代RPR的梅毒抗体理想的筛查试验。
   使用基因工程技术生产免疫测定标记用酶,是得到符合标记要求的高纯度酶的一条新途径,如直接以与其他蛋白(抗体或抗原)融合的方式表达,不但避免了繁琐且低效率的酶与蛋白的化学交联,而且无需得到纯化的酶和抗体或抗原。随着分子生物学技术的发展,将有越来越多的酶免疫测定方法建立在基因工程酶或其融合蛋白的基础之上。

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