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抗体效价的检测、抗体的纯化你了解多少吗?

人阅读 发布时间:2019-04-16 16:40

      抗体:机体在抗原物质刺激下,由B细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。免疫球蛋白英文缩写为Ig.

      抗体的效价:指抗体的物理状态及其在体内的滞留时间,以其与抗原反应的多少来表示其免疫效果

抗体效价的检测(一般用ELISA间接法进行检测)
1)2个参照:阴性参照为预取血血清,均以1抗起始浓度稀释;阳性参照为以前阳性血清或者细胞上清
2)于96空板中每孔适量的抗原,边沿孔应尽量避免使用,会降低细光值,影响结果。于4℃过夜,紧急情况也可以37℃孵育2小时。
3)倒掉抗原,每孔加入200ul的封闭液,4℃过夜或者37℃孵育2小时。
4)倒去封闭液,在吸水纸上拍打尽量吸干残留液体,用洗涤液洗板三次,每次尽量拍干残留液体,若要放置一段时间,尽量风干板子,或30℃烘干并用封口袋封好于-20℃存放。
5)取包好的96孔板,第一孔加入阴性参照液50ul,第二孔加入阳性参照液50ul,第三孔加入稀释的抗体(1:500=抗体:封闭稀释液),后面的第四孔到第12孔加入50ul的封闭稀释液,然后取50ul稀释的抗体进行梯度稀释,第12孔取出50ul的液体,保证每孔液体为50ul。再于37℃孵育1 小时。
6)倒掉液体,用洗涤液洗板三次,拍干。每孔加入100ul的HRP标记的2抗(1:2000),于37℃孵育45分钟。
7)倒掉液体,有洗涤液洗板三次,拍干。每孔加入100ul的TMB底物(A+B等体积配置,现配现用)温室孵育520分钟(根据颜色的改变速度)。
8)每孔加入100ul的终止液(0.M草酸),在酶标仪上读取450nm的吸光度。


抗体的纯化。(一般用亲和纯化,这种方法得到的抗体的纯度高一些。)
(1) 亲和柱的制备
1)称取0.3mg溴化QING活化的琼脂糖凝胶加入1mmol/L的盐酸中,4`C过夜使其充分溶涨,可获得1ml溶涨胶。
2)将凝胶转移入纯化柱中,用约30ml 1mmol/L的盐酸洗介质3次。
3)用偶联缓冲液洗介质一次,因为活化基团在偶联缓冲液PH值下易水解,所以此步骤zui hao在几分钟内完成。
4)将溶解在5ml偶联缓冲液中的10-60nmol的配体加入凝胶中,如需测定结合效率一定要取少量陪体溶液待测。
5)温室下轻轻混合摇动2小时,或4`C过夜,如需测定结合效率此步骤结束后取少量溶液待测。
6)用30ml的偶联缓冲液洗介质一次。
7)加入15ml阻断缓冲液温室孵育2小时或4`C过夜。
8)依次用20ml的偶联缓冲液和20ml的乙酸盐缓冲液洗介质一次。重复4次步骤8。
9)重复4次步骤8。
10)配体固相化完成,可用于纯化。
11)若不立即使用,用20%的乙醇封存。
(2)抗体的纯化
1)原血清用PBS等体积稀释,混匀1min,5000-10000r/min,4-20离心15分钟,取上清,并留样送检。
2)用层析仪或手工,10倍体积的PBS 2-4ml/min流速清洗平衡柱子。
3)稀释离心完的上清样品,0.5-1ml/min流速上样。
4)上样完后,用15倍体积的PBS2-4ml/min流速清洗平衡柱子,洗去柱子上残留的杂蛋白。
5)用5-10倍体积的Anitibody Elute Buffer C 洗脱结合在亲和柱子上的抗体,分管收集,没管收集1ml并预先滴加100ul Anitibody Elurte Buffer D调PH至中性(PH7-7.5),如果有层析仪也可以根据层析仪紫外吸收峰检测收集。
6)洗脱完毕后,柱子用5倍体积的PBS 2-4mi/min流速清洗平衡。
7)用20%的酒精封存柱子,4`C保存。
(3)抗体的浓缩
1)一般收集浓度较高的几管洗脱液,无须浓缩,若弄多实在太低(小于0.5mg/ml),则将收集的馏分加和起来。
2)转移入15ml 的超滤管,3500r/min离心20分钟左右(根据要浓缩的体积摸索离心时间),将浓缩好的抗体小心的用移液器取出来。
3)取700ul 浓缩的抗体检测280nm的吸光度,读数不要超过2,用吸光度读数除以1.35,即为抗体的大致浓度。抗体的浓度也可以用(OD280nm-0.35xOD495nm)1.4这个公式计算。浓缩的程度:使抗体的浓度在0.5-1mg/ml之间最hao。最hou通过浓度x体积计算抗体的总量。
(4)抗体的保存
抗体中添加40-50%甘油,可以短时间存放于4℃,如需以后使用,一般500ul/管冻存于-20℃或者更低温度的冰箱中。
(5)抗体纯度的鉴定
一般而言,我们在将抗体纯化以后,如果想知道抗体的纯度和浓度究竟怎么样,就需要走个SDS-PAGE电泳。电泳的方法在网上到处都是,在此就不多说

 

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