细菌的培养

一、目的
学习细菌的培养方法及培养基的配置。
二、原理
在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。特别是常用的大肠杆菌。
大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。此时菌体密度可达到1×10⁹~2×10⁹/mL。
培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。实验室中最常用的是LB培养基。
三、实验材料、试剂与主要仪器
（一） 实验材料
大肠杆菌
（二） 试剂
1、胰蛋白胨
2、酵母提取物
3、氯化钠
4、1mol/LNaOH
5、琼脂粉
6、抗生素（氨苄青霉素、卡那霉素等）
（三）仪器
1、培养皿
2、带帽试管
3、涂布器
4、灭菌锅
5、无菌操作台（含酒精灯、接种环、灭菌牙签等）
6、恒温摇床
四、操作步骤
（一）LB培养基的配制
配制每升培养基，应在950m1去离子水中加入：
细菌培养用胰蛋白胨 10g
细菌培养用酵母提取物 5g
NaCl 10g
摇动容器直至溶质完全溶解，用1mol/L NaOH调节pH位至7.0。加入去离子水至总体积为lL，在15 lbf／in² (1.034×10⁵Pa)高压下蒸气灭菌20min，即为LB液体培养基。
LB固体培养基是在其液体培养基的基础上另加琼脂粉15g/L。
（二）细菌的培养
（１）在液体培养基中培养

1、过夜培养
⑴取5ml液体培养基加入一只无菌的试管中。
⑵用接种环或灭菌牙签挑一个单菌落，接种于培养液中。
⑶盖好试管，在摇床上以60r/min速度，于37℃过夜培养。
２、大体积培养
⑴按1∶100的比例将过夜培养物加入到一无菌烧瓶中，烧瓶的体积应该是培养液体积的5倍以上。
⑵于37℃，约300r/min剧烈摇动培养。
（２）在固体培养基中培养 细菌在固体培养基上培养主要是为了获得单菌落和短期保存。
平板划线法分离单菌落
⑴采用无菌技术，用接种环将接种物从平板的一侧开始划线。
⑵重新消毒接种环，从第一划线处将样品划线至平板的其余部分，重复划线直至覆盖整个平板。
⑶于37℃培养直至长出单菌落。


水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA
目的
学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的纯度，DNA的构型，含量以及分子量的大小。
原理
水平式琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中最常规的实验方法，它简单易行，只需少量的DNA就能检测，其分辨效果比分光光度计法与溴化乙啶-标准浓度DNA比较法更高，更直接，检测DNA范围更广，其原理是溴化乙啶在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物；使得DAN发射的荧光，增强几十倍。而荧光的强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品做琼脂糖凝胶电泳的对照，就可比较出待测样品的浓度。若用薄层分析扫描仪检测，则可精确地测得样品的浓度。电泳后的琼脂糖凝胶块直接在紫外光下照射拍照，只需5~10ng DNA ，就可以从照片上比较鉴别。如肉眼观察，可检测到0.01~0.1ng的DNA。
在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比。质粒DNA样品用单一切点的酶酶切后与已知分子量大小的标准DNA片段进行电泳对照，观察其迁移距离，就可以该样品的分子量大小。凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA，也可鉴别分子量相同，但构型不同的DNA分子。在抽提质粒的过程中，由于各种因素的影响，使得超螺旋共价闭环结构的DNA（SC）的一条链断裂，变成开环（OS）分子，如果两条链发生断裂，就变成线形分子（L）分子。这三种构型的分子有不同的迁移率。在一般情况下，超螺旋迁移速度最快，其次为线形分子，最慢的为开环分子。
当提取到的质粒DNA样品中还有染色体DNA或RNA，在琼脂糖电泳上也可以分别观察到电泳区带，由此可以分析样品的纯度。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应，前者由分子所带净电荷的多少而定，后者则主要与分子大小及构型有关。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷。在电场中向着正极移动，在用电泳法检测DNA分子时，应当尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应，使得分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度差异所决定，提高分辨率。同时适当降低电泳时的电压，也可以使分子筛效应相应增强而提高分辨率。
试剂与器材
一、试剂
1、 DNA样品
2、 TBE缓冲液（5×）：用时需稀释10倍
3、 点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油
4、 溴乙啶染色液(EB)：10mg/ml溴乙啶 注意：该试剂具致癌作用，用时要小心。
5、 琼脂糖
二、器材
1、 电泳仪系统
2、 紫外灯
3、 恒温水浴箱

操作步骤
1． 选择合适的水平式电泳仪，调节电泳槽平面至水平，检测稳压电源与正负极的线路。
2． 选择孔径大小适宜的点样梳，垂直架在电泳槽负极的一端，使得点样梳的底部与电泳槽水平面的距离为0.5~1.0mm。
3． 制备琼脂糖凝胶：按照被分离的DAN分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。一般情况下可参考下表：

琼脂糖的含量（%） g/ml	分离线状DNA分子的有限范围(kb)
0.3	60~5
0.6	20~1
0.7	10~0.8
0.9	7~0.5
1.2	6~0.4
1.5	4~0.2
2.0	3~0.1

称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，一般配制约40ml 凝胶液，置微波炉中或水浴加
热，至琼脂糖融化均匀。
4． 将凝胶槽洗净擦干，两端用胶布封好，在一端插好梳子。待凝胶溶液冷却至60℃
左右时，在凝胶溶液中加EB（EB最终浓度为0.5 μg/ml），摇匀，轻轻倒入电泳槽水平板上，除掉气泡。待凝胶完全凝固后，去掉两端封条，将凝胶槽移至电泳槽（槽中已加入TBE缓冲液），然后小心地拔掉梳子保持点样孔完整。
注意：电极缓冲液要高出凝胶面2-5㎜。
5． 待测的DNA样品中，加入1/5体积的点样缓冲液，混匀后小心的进行点样，记录样
品点样顺序和点样量。
6． 开启电源开关，最高电压不超过5V/cm。
7． 电泳时间看实验的具体要求而异，在电泳中途可用紫外灯直接观察，DNA各条区带
分开后电泳结束。一般20min—3 h，取电泳凝胶块直接拍照。


RNA提取与纯化
一、目的
掌握RNA提取的基本技术，了解RNA提取过程中的各种注意事项。
二、原理
RNA提取是分子生物学实验中难度较大的实验技术。
RNA提取和DNA提取有类似的地方，因为它们都是核酸，都具有较好的水溶性。提取RNA首先破碎细胞，然后用提取液将RNA溶出，反复抽提去除蛋白质，加入乙醇沉淀RNA，将RNA沉淀溶解备用。那么如何区分DNA和RNA分开？DNA和RNA的溶解性不同，DNA在1M的盐溶液中具有最好的溶解度，而RNA在0.14M的盐溶液中具有最好的溶解度，所以可以利用它们的溶解性将它们进行区分。另外，RNA的分子量一般比较小，而DNA分子很大且和蛋白结合成复合体，所以DNA更容易随蛋白沉淀，而RNA具有较好的溶解性。
RNA提取的另一个关键问题就是如何抑制或去除环境中RNA酶。所有的玻璃、陶瓷和铁器具在180℃×6 h以上。所有的塑料器皿用0.1％的DEPC水37℃过夜浸泡，然后湿热灭菌80℃烘干备用。配制溶液所需的水也要用DEPC处理过的水，而配置Tris相关的缓冲液时Tris会与DEPC发生反应，应避免用DEPC处理。另外操作过程中应戴手套。
判断RNA 的质量主要有两个标准，一是纯度，二是完整性（是否被降解）。RNA的纯度可以通过分光光度计进行测定的A260／A280值来判断。RNA的完整性主要通过电泳分析来阐明，未降解的总RNA电泳时在凝胶中会出现18S和28SrRNA对应的条带（如果有DNA污染则在RNA后会发现基因组DNA对应的条带）。RNA电泳系统也要严格对RNA酶进行处理。如果用普通琼脂糖凝胶电泳，则用尽量减少电泳时间。
三、试剂与器材
（一）试剂
1、暗培养7天的小麦苗，用前光照诱导3 h
2、DEPC
3、DEPC处理的ddH₂O
4、RNA提取液：（每1000毫升中含有）
Tris 6.06 克 (最终浓度为50 mM )
LiCl 6.03 克 (LiCl -H₂O9.06克) (最终浓度为150 mM )
EDTA（0.5 M） 10 毫升 (最终浓度为5 mM )
SDS 50 克 (最终浓度为5 % )
5、8 M Li Cl：33.92克Li Cl 溶于100 ml DEPC处理的ddH₂O
1、 水饱和酚
2、 氯fang
3、 0.5M NaCl
4、 溴乙啶(EB)： 10mg/ml溴乙啶。 注意：该试剂具致癌作用，用时要小心。
10、点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油。
二、器材
1、 分光光度计
2、 电泳仪
3、 台式离心机
4、 手提式紫外监测仪
5、 恒温水浴
6、 凝胶成像系统
四、操作步骤
1、取植物叶片1-3克，放在液氮中磨成粉末。(可以多研磨一些，然后分装，小量提取试剂量可减至1／10)
2、液氮挥发完之前，倒入含有10 毫升RNA提取液的离心管中，迅速反复倒置混匀，直至看不见任何团状物为止。
3、立即加入10毫升的等体积（酸性）酚/氯fang，剧烈（！）反复倒置混匀5至10min（如在震荡器上震荡，要确保混匀而不能仅仅是振动！）。
4、13000g×5min，吸管取上清（注意避免吸取界面上的蛋白）。
5、重复步骤3和4，三次左右（注意观察界面上白色物质）。
6、取上清，加入等体积的氯fang，反复倒置混匀2-5min。
7、13000g×5min。
8、取上清，加入1/3体积8 M 的 LiCl （即8 M LiCl应占最后体积的25%）， 沉淀RNA，4℃过夜。
9、离心13000g × 10 min。
10、弃上清,保留沉淀（此时应把RNA沉淀转入Eppendorf管中，以便于操作）, 加入70%无水乙醇+30% 0.5 M NaCl 的混合液0.5 毫升洗涤沉淀数分钟（和缓地反复倒置混匀），离心 （13000g × 2 min）。重复洗涤沉淀数次。
11、用70%乙醇再洗涤2次沉淀，去掉盐离子。
12、用枪头吸去残留的液体，真空干燥2min。
13、加入200ulDEPC 处理过的水溶解RNA。
14、取用5ul电泳检测RNA完整性, 用TEB 缓冲液, 200V× 20-30min。
15、取5 ul稀释40倍测定RNA纯度和浓度，A260 nm /A280 nm应在 2.0 左右。
16、将RNA 分装,放在-70℃长期保存备用.
辅助方案：试剂盒提取法（Trizol）
（一）试剂：
1.Ttizol Reagent
2.氯fang
3.异bing醇
4.70%无水乙醇
5.DEPC
（二）器材：
1、研钵
2、离心机
（三）实验步骤
1、称取小麦叶片50-100mg,于研钵中加液氮研磨成粉末，迅速转移到1.5ml离心管中。
2、加入1 ml Trizol Reagent，15～30℃×5min。
3、加入0.2ml氯fang，剧烈振荡15 sec，15～30℃×3min。
4、冷冻离心12 000 rpm×15min。
5、将上清液转移到另一个离心管中，加0.5ml预冷异bing醇,混匀 ，-20℃放置20min。
6、冷冻离心12 000 rpm×10min。
7、加入0.5ml 70% 乙醇洗RNA沉淀，悬浮，7500 rpm×2min，除去乙醇。
加入30 ul DEPC 处理过的ddH₂O溶解RNA。


感受态细胞的制备及转化
目的
掌握感受态细胞制备和转化的基本方法。
原理
受体细胞经过一些特殊方法如电击法, 化学试剂法（CaCl2 ,RbCl，KCl)等的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。
试剂与器材
一、试剂
1、0.1mol/L CaCl₂取20ul PCR产物进行1.2%琼脂糖电泳分析。
2、LB液体培养基（见实验一）
3、LB固体培养基（见实验一）
4、氨苄青霉素（100mg/mL）
二、器材
1、 冷冻离心机
2、 平衡天平
3、 无菌操作台
4、 微量移液器
操作步骤
一.感受态细胞的制备(0.1MCaCl₂方法)
1、从LB固体平板挑单克隆于5ml LB液体培养基中(不加抗生素)，37℃×200rpm×12-16h，可过夜培养。
2、将活化菌体按1`～5％接种到LB中，扩大培养37℃×200rpm×2h，至OD₆₀₀约为0.4。
3、取培养好的菌液1.5 ml于一离心管中，4℃离心8 000rpm×1 min。
4、弃上清，加500 ul 0.1M CaCl₂ (灭菌预冷)洗菌体，4℃冷冻离心8000rpm×1 min。
5、彻底除去残液, 加200 ul 0.1M CaCl₂ (灭菌预冷)，悬浮菌体。
6、冰浴静置 30 min ，4℃冷冻离心8000rpm×1 min。
7、弃上清，加100 ul 0.1M CaCl₂ (灭菌预冷)，悬浮菌体，即为制备好的感受态细胞。
附注：
①、整个过程注意无菌操作和保持低温。
②、培养物处于对数生长期是制备感受态细胞的关键。
③、如果要求高转化效率，不建议使用简单深冻保存的感受态细胞。
④、LB液体培养基建议用不加抗生素和加抗生素的两种培养基，检查菌体是否污染。
⑤、D₆₀₀值指细胞密度，用于判断培养物是否处于对数生长期。OD₆₀₀值在0.4 - 0.5时，此时培养物处于对数生长期，细胞数在20min内加倍。
二、质粒对大肠杆菌的转化
1、将连接产物加入100 ul制备好的感受态细胞，冰上放置30 min。
2、42℃热激90S。
3、迅速冰浴3min。
4、加入300 ul LB液体培养基，37℃轻摇培养45min。
5、加入30 ul X-gal和6 ulIPTG,混匀。
6、取100 ul涂布在含有50 ug/ml氨苄的LB固体培养基中。
7、37℃倒置，避光培养16-20 h。
8、蓝白斑筛选，挑取单菌落进行菌落PCR鉴定。