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关于ELISA实验测定成果过错的原因总结

发布时间:2018-09-21 10:12 点击次数:

     Engvall 和Perlmann于1971年使用将酶附着于抗原或者抗体,经过化学反响的测定终产物颜色的方法进行了IgG的定量测定,并命名为"enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)"也就是我们所说的即酶联免疫吸附试验,这种固相酶免疫测定方法已经在科研范畴得到了广泛的使用。

       ELISA方法被广泛使用于各种抗原和抗体测定,具有灵敏度高,操作简单等长处,但是在具体试验过程中影响要素较多,而且要按照严厉的说明要求,在临床查验中除正常反响外,有时常可见到一些过错成果(即假阳性或假阴性成果)。
引起ELISA测定过错成果的原因主要有:①标本要素;②试剂要素;③操作要素。本文就标本要素对ELISA测定的影响做如下评论。

血清是最常用的ELISA标本,血浆一般可视为与血清平等的标本,标本引起的假阳性和假阴性成果主要是搅扰性物质所构成的,分为内源性物质和外源性物质两种:

1. 内源性物质
      普遍认为大约40%的人血清标本中含有非特异性搅扰物质,能够不同程度影响检测成果。常见的搅扰物质有:类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原本身抗体、医源性诱导的抗鼠Ig (s)抗体、穿插反响物质和其它物质等。
(1)类风湿因子
人血清中IgM、IgG型类风湿因子(RF)能够与ELISA体系中的捕获抗体及酶符号二抗的FC段直接结合,然后导致假阳性。处理该状况的方法是:①用F(ab)2代替完好的IgG;②标本用联有热变性(63℃,10 min)IgG的固相吸附剂处理(将热变性IgG参加到标本稀释液中同样有用);③检测抗原时,能够用等参加到标本稀释液中,使RF降解。
(2)补体
ELISA体系中固相一抗和符号二抗过程中,抗体分子发作变构,其FC段的补体C1q分子结合位点被露出出来,使C1q 能够将二者连接起来,然后构成假阳性。处理的方法是:①用EDTA稀释标本;②用53℃,10 min或56℃,30 min加热血清使C1q灭活。
(3)嗜异性抗体
人类血清中含有能与啮齿类动物(如鼠等)Ig (s) 结合的天然嗜异性抗体,可将ELISA体系中一抗和二抗连接起来,也能构成假阳性。处理的方法是:可在标本稀释液中参加过量的动物Ig (s) ,但参加量缺乏或亚类不一起无效。
(4)嗜靶抗原的本身抗体
抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素等嗜靶抗原的本身抗体,有时能与靶抗原结合构成复合物,在ELISA方法中均可搅扰抗原抗体测定成果。为防止以上状况呈现,处理的方法是:测定前需用理化方法将其解离后再测定。
(5)医源性诱导的抗鼠Ig (s) 抗体
临床展开的用鼠源性CD3等单克隆抗体医治,用放射性同位素符号鼠源性抗体的影像确诊及靶向医治等新技术,均有可能使这些患者体内发生抗鼠抗体;别的,被鼠等啮齿类动物咬伤的患者体内也能够发生抗鼠Ig (s) 抗体。这些患者ELISA测守时均可发生假阳性。处理的方法是:测定抗原时,在标本中参加足量的正常鼠Ig (s) ,然后战胜因为上述原因构成的假阳性。
(6)穿插反响物质
类类AFP样物质等,是与靶抗原有穿插反响的物质。在用多抗测定抗原时对测定成果影响不大,但在用单克隆抗体测定抗原时,如果穿插抗原决定簇正好是所用单克隆抗体相对应的靶决定簇时,也会呈现假阳性成果。
(7)标本中其它成分的影响 血清脂质过高、胆红素、血红蛋白及血液粘度过大等,均对ELISA测定成果有搅扰效果。

2. 外源性物质
外源性物质常常是因为用于ELISA测定的血标本的收集、储存不妥等原因所构成的。如标本溶血、标本被细菌污染、标本储存过久、标本凝聚不全和采血管中添加物等影响。
(1)标本溶血 
因为各种人为原因引起的标本溶血,均可因红细胞损坏溶解时释放出很多具有过氧化物酶活性的血红蛋白,在以辣根过氧化物酶为符号的ELISA测定中,会导致非特异性显色,搅扰测定成果。为战胜上述搅扰效果,标本收集时有必要留意防止溶血。
(2)标本受细菌污染 
因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶,因而,被细菌污染的标本同溶血标本一样,亦可发生非特异性显色而搅扰测定成果。
(3)标本保存不妥
在冰箱中保存过久的标本,血清中IgG可聚合成多聚体、AFP可构成二聚体,在间接法ELISA测定中会导致本底过深、乃至构成假阳性;标本放置时刻过长(如一天以上),有时抗原或抗体免疫活性削弱,亦可呈现假阴性。为战胜上述搅扰,ELISA测定的血清标本宜为新鲜收集;如不能当即测定,5天内测定的血清标本可存放于4℃,1周后测定的血清标本应低温冻存;冻存后融解的标本,蛋白质部分浓缩,散布不均,应充沛混合后再测定,但混匀时应轻柔,不行激烈振动。
(4)标本凝聚不全
在没有促凝剂和抗凝剂存在的状况下,正常血液收集后1/2~2h开端凝结,18~24h彻底凝结。临床查验工作中,有时为了争取时刻快速检测,常在血液还未开端凝结时即强行离心别离血清,此刻的血清中仍残留部分纤维蛋白原,在ELISA测定过程中能够构成肉眼可见的纤维蛋白块,易构成假阳性成果;这类状况于次日复查时因血凝已彻底,血清中不再有纤维蛋白原存在,故复查成果变为阴性。为防止上述搅扰效果,处理的方法最好是血液标本收集后有必要使其充沛凝结后再别离血清,或标本收集时用带别离胶的采血管或于采血管中参加恰当的促凝剂。
(5)标本管中添加物质的影响
抗凝剂(如肝素,EDTA)、酶抑制剂(如NaN3可抑制ELISA体系中辣根过氧化物酶活性)及快速别离血清的别离胶等均对ELISA测定有必定搅扰效果。
经过以上的剖析和总结,临床查验ELISA测定中呈现假阳性或假阴性等过错的成果,扫除ELISA试剂盒要素和操作要素,再有就是从标本要素进行剖析,并应采纳相应措施扫除搅扰,然后保证检测成果的准确性