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如何拯救被污染的细胞吗?

发布时间:2018-09-03 11:09 点击次数:

对于贴壁生长的细胞,相对来说比较简单但很麻烦。以下我主要讨论贴壁生长的细胞。 在讨论之前,大家首先要有一个概念,即洁净区,并不是没有细菌,而是细菌的数量非常少,国家标准100级的洁净标准是浮游菌数不得超过5个每立方米,沉降菌数不得超过1个每培养皿.而国外的标准比我国的还要高一点,要求的数量更少。 所以在我们的洁净操作台里,并不是真正一个细菌都没有的,所以在操作的时候还是要尽量利索迅速地完成操作。尽量减少进入培养体系细菌的数量。 
所以处理细菌污染的重要原则就是:无限地稀释细菌的浓度,无限地减少细菌的数量!
1).将污染的培养液倒掉,转烧瓶口,加入10mlPBS,适当晃动清洗培养瓶,然后倒掉。转烧瓶口。 
2).继续加入10mlPBS,同样方法晃动,清洗培养瓶,然后倒掉。 
3).继续加入5mlPBS,同样方法洗瓶,主要是培养面,然后倒掉。 
4).重复步骤3再洗。 
5).重复步骤3再洗。 
6).加入3-5ml双抗,洗瓶,静置3-5分钟,然后吸出。 
7).加入3ml双抗,洗瓶,静置3-5分钟,然后吸出。 
8).再加入5mlPBS洗瓶,然后吸出。 
9).加入10ml培养液,加入2ml双抗,放置培养箱培养,5小时之后,倒掉培养基,加入PBS洗瓶两次,然后加入胰酶消化,吹打后置于离心机800-1000r/min离心,然后洗一次。置于新的培养瓶里培养,培养体系加入2ml双抗。 
10).24h之后,视情况换液,若仍然污染严重,培养基浑浊,重复以上步骤,若看不到污染物,则继续步骤1)、3)、4)、6)、8),然后加入培养液培养,培养体系加入2ml双抗. 
11).24h之后,若仍污染严重,可再重复一次,若还污染只能弃之(不过一般没有出现这种情况),若镜下不见污染物,则换液PBS洗瓶,正常培养。 
 
以上是对于细菌污染(常见为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌);若为霉菌或者真菌污染,加入两性霉素B清洗和培养,终浓度一般为2.5μg/ml(在30μg/ml时会有细胞毒性)。另外也可以选择在培养基里加3ug/ml的制霉菌素或放线菌素D。 其它操作同;若为支原体或者黑胶虫污染,因为这个太难处理,所以我基本上都是重新弄细胞了。处理的代价更大更麻烦。但是也是有专门针对黑胶虫和支原体污染的试剂的,但是我没有试过。比较贵呵呵。 
 
有同学说用泰乐处理支原体污染效果比较好。大家可以试试,我下次也会试一试。至于黑胶虫的话,我觉得真的是没有办法了,还是需要你在无菌观念和无菌操作上下大功夫加强了,真的黑胶虫在科研领域还是很未知的啊。所以没有什么好的应对方法。预防为主!!还是要强调无菌操作啊!尤其注意血清的质量!这个是主要来源。一般建议用北美血清,这个黑胶虫污染会概率小。
 
以上方法主要是针对贴壁生长的细胞,在操作的过程中,一定要小心操作动作,轻柔缓慢,切忌大动作鲁莽。防止细胞脱落。以上方法操作得当,基本上都能救活你的细胞(我还没有听到没救活的反馈)。当然如果你的细胞仍有富余或者冻存的,我还是建议你把污染的扔掉,再复苏方便省事。这个拯救细胞还是主要针对你就只剩这一瓶细胞无路可退的时候。