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如何选择合适的蛋白含量测定方法?

发布时间:2018-08-29 15:51 点击次数:

对许多实验来说,确定蛋白样品浓度是至关重要的。如果在2D电泳中,蛋白过多或过少,产生的后果都将是相当严重的。大多数蛋白样品可通过比色测定法定量。在典型的蛋白测定中,化学试剂加入到蛋白样品溶液里产生颜色变化,这一变化可由分光光度计或酶标仪 检测,并与已知浓度的蛋白标准曲线作比较。Bio–Rad 提供了4种蛋白测定手段,每种都有其独特的优点。

Quick Start Bradford 蛋白测定是一种简单、精确的蛋白浓度定量方法。现成的1倍浓度染料和7 个预稀释浓度(0.125、0.25、0.5、 0.75、1.0、1.5、2.0 mg/ml)的蛋白标准品,让你拥有现成的检测工具。无需稀释标准品和染料,一步完成蛋白浓度定量。

Bio–Rad 蛋白测定 也是一种简单的蛋白浓度测定方法。该方法适应标准浓度测定、低浓度微量测定,或96孔微孔板的快速测定。它的基本原理和流程和上面的Quick Start Bradford都是一样的,不过要麻烦一点点。因为除了要稀释蛋白标准品,配成几个不同浓度之外,还要稀释染料,再过滤除去不溶颗粒。后面的步骤就没有区别了,还有一点小差别就是价格。不过联想一下奶粉和液体奶,就会想通了吧。

Quick Start Bradford 和Bio–Rad 蛋白测定方法的起源都是Bradford染料结合方法 (Bradford 1976),该方法检测考马斯亮蓝G–250染料与蛋白结合时(主要结合碱性或芳香族氨基酸残基)的颜色变化。这种测定方法能定量多数蛋白或多肽(分子 量> 3,000–5,000 Da),操作简单、速度快,灵敏度高,与一些还原剂(如DTT、巯基乙醇)兼容。但有些去垢剂、黄酮、碱性缓冲液会干扰测定。

DC (Detergent Compatible) 蛋白测定 是一种适用于含有去垢剂的蛋白样品比色测定方法。该方法类似于常规的Lowry 测定方法 (Lowry et al.1951),但经过改良,节省了操作时间。DC 蛋白测定只需要15分钟的温育过程,而且吸光值读数能保持2小时的稳定。它可以兼容NaOH和多种去污剂,如10% SDS、2% NP-40、1% CHAPS、1% Triton X-100等,但还原剂还是会干扰测定。

RC DC (Reducing agent Compatible & Detergent Compatible) 蛋白测 定是一种适用于含还原剂和去垢剂的蛋白样品比色测定方法。以 Lowry 方法(Lowry et al.1951)为基础的 RC DC 蛋白测定,具有原来DC蛋白测定的特点,并能与更多的试剂兼容,简化了复杂蛋白样品溶液的定量测定。吸光值至少稳定1小时。除了与DC 蛋白测定兼容的试剂外,RC DC 蛋白测定还与以下试剂和缓冲液兼容:2% CHAPS、350 mM DTT、0.1M EDTA 、Laemmli 缓冲液、10% beta-巯基乙醇、ReadyPrep 抽提试剂等。

选择合适的蛋白标准

大家可能从来没有在意过蛋白标准,认为不就是BSA嘛。其实不然。在蛋白测定中,最好的标准品是待测蛋白的纯化制品。当没有这种绝对的对照蛋白时,可以选择另一种蛋白作为相对标准。如果是用Bradford方法测定,不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大,无可比性。因此在蛋白测定之前,最好是参照要测试的样本的化学构成,寻找化学构成类似的标准蛋白作标准品。如果只需要相对蛋白浓度,那么任何一种纯化蛋白均可作为对照标准品。

Bio–Rad 提供两种蛋白标准品,小牛gamma−球蛋白和牛血清白蛋白(BSA)标准品。当你用Quick Start Bradford和Bio–Rad 蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度时,那么标准品的选择就要慎重一些。如果你的样品中主要含有白蛋白,那么BSA将是一个好选择。如果你的样品包含了多种蛋白,gamma-球蛋白可能更合适。而DC和RC DC蛋白测定就几乎不受到标准品的影响,你爱选哪个选哪个。不过假如你想比较几个蛋白的量时,最好还是用同一种标准品。

选择合适的蛋白测定方法

正如一个硬币的正反面,每种蛋白测定方法都有其优缺点。当你选择一种蛋白测定方法时,需要考虑两个重要因素:缓冲液的化学组成和检测的蛋白量。基于 Bradford方法的Quick Start Bradford和Bio–Rad 蛋白测定灵敏度高,可以兼容糖、巯基乙醇、DTT等。而对于去污剂和NaOH这两种干扰Bradford测定的物质,DC蛋白测定却可以兼容。如果蛋白是在loading buffer中,准备跑1D或2D电泳,或者刚从细胞裂解液中抽提出来,需要定量,那么RC DC蛋白测定更合适。下表总结了每一种蛋白测定方法的特点。

比色皿

最后还要提一下比色皿这个小东西。一般定量核酸和紫外定量蛋白,都是采用石英杯或者玻璃杯,但是不适合比色法测定蛋白质。因为反应中的染料(如考马斯亮蓝)能让石英和玻璃着色,所以必须采用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不适合用于在紫外范围内测试样品。Bio-Rad也提供了一次性的比色皿。这些比色皿可直接用于样品的混匀,这样你就省掉了转移溶液的麻烦。而且比色皿所需的样品体积只是标准反应的一半左右,因此每个试剂盒的使用次数实际上变成了两倍。另外,它的非光学面是凹槽设计,非常容易拿捏,而且不容易搞错,在光学面上留下指纹或在分光光度计中放反了方向。

蛋白定量这个看似简单的实验中,也蕴藏了不少学问,所以还是要有一双慧眼,来选择最适合的试剂盒。