辛基-琼脂糖凝胶H.P.使用方法

中文名称：辛基-琼脂糖凝胶H.P.
英文名称：Octyl-Sepharose 4FF
凝胶类型：疏水层析填料
结构成分：6%交联琼脂糖
粒径：24-44μm
工作PH值：3-13
操作温度：4-40℃
性状：白色微球,凝胶状，保存在20%酒精溶液中
用途：生化研究，疏水层析介质，高分辨率，适合生物大分子和疫苗的分离纯化等。
保存条件：RT
操作温度：室温
储存条件：4～28℃

使用方法：
1．装柱
① 将所有的试剂和填料达到室温.配制初始缓冲液(平衡液)和缓冲液。
② 根据柱子大小取所需凝胶的量，清洗掉20%乙醇，抽干，用初始缓冲液（按凝胶:缓冲液=3:1比例）配成匀浆。
③ 将柱内及柱子底端用水或缓冲液润湿并保持一小段液体（液面略高于滤膜），务必使底端无气泡。
④ 用玻璃棒引导匀浆沿着柱内壁一次性倒入柱内，注意不要使用气泡。打开柱子出液口，使凝胶在柱内自由沉降，连结好柱子顶端柱头。
⑤ 打开蠕动泵，让缓冲液用使用时流速的1.33倍的流速流过，使柱床稳定。用2-3倍柱体积的缓冲液平衡柱子。

2．平衡
让平衡缓冲液以一定流速流过柱子，到流出液电导和pH不变。平衡缓冲液一般是高盐浓度的缓冲液，如：0.02～0.05mol/L的PBS加1～2.5mol/L(NH4)2SO4等。

3．上样
① 样品用平衡液配制，浑浊的样品要离心、过滤后上柱；
② 一般情况是让目标产品结合在柱子上，用平衡洗液洗去杂质，再选择一种洗脱液洗下目标产品。
③ 介质对样品组分吸附的程度取决于样品的疏水性质、流动相的离子强度和温度。温度越大、盐浓度越高或样品组分疏水性越强，介质对组分吸附越牢。

4．洗脱
疏水介质可用减小盐浓度进行洗脱。加表面活性剂或者有机溶剂可加强洗脱。最常用的洗脱液是低盐浓度缓冲液，如：0.02～0.05mol/L的PBS。

5．再生
一般用低盐浓度的缓冲液洗，洗10倍以上柱体积，接着用结合蛋白的平衡液洗到平衡，可再次使用。若有失活的蛋白或者脂类物质在再生时洗不掉，可用在位清洗（CIP）除去。

6．在位清洗
① 对于以离子键结合上去的蛋白，可以用2M NaCl去除。
② 对沉淀蛋白、以疏水作用结合的蛋白或者脂类物质，可用1M  NaOH去除。
③ 对强疏水性结合的蛋白、脂类等，可用4～10倍柱体积的70%乙醇或30%异丙醇清洗，但要注意有机溶剂的浓度以梯度的方式逐渐增加，否则容易产生气泡。清洗完毕后，用至少3倍柱体积缓冲液平衡柱子。

7．去热源
用0.5M的氢氧化钠清洗柱子5～6小时或者用0.1M的氢氧化钠24小时。或用以下步骤去除：
① 2倍柱体积的70%的乙醇；
（2)2倍柱体积50mM Tris-HCl pH7.5
③ 1倍柱体积4M尿素
④ 3倍柱体积的Tris缓冲液+0.1M NaCl;
以上缓冲液都在无热源的双蒸水中配制。

8．消毒
用0.5～1.0M NaOH室温下洗8～10倍柱体积，初始缓冲液平衡柱子。

注意事项：
1．密封贮存于4～28℃（保存溶液为20%乙醇+0.1M醋酸钠），通风、干燥的地方，不能冷冻。用过的柱子贮存于4℃（20%乙醇）。
2．在装柱、使用和保存柱子的时候，要避免柱子流干，气泡进入。