微丝染色液(R250法)操作步骤

    微丝是肌动蛋白组成的纤维状细胞器。直径5～8nm，成束存在或散在分布。微丝在细胞质中是一种动态结构，肌动蛋白单体呈球状(G-肌动蛋白)，在适宜条件下可装配成丝状(F-肌动蛋白)，并由两条F-肌动蛋白缠绕成双螺旋结构，即微丝。由于G-肌动蛋白与F-肌动蛋白可相互转化，微丝并不稳定，易受多种因素影响，如细胞松弛素B可抑制微丝的装配，而鬼笔环肽则可抑制其解聚。微丝在所有细胞中参与组成细胞骨架，有保持细胞形状和维持细胞结构稳定性的作用。微丝还能参与细胞的运动，但当其单独存在时无收缩作用，必须有收缩蛋白，特别是肌球蛋白存在时才能收缩。

    一般认为，在非肌肉细胞中，微丝可推动细胞质流动，参与细胞的变形运动，胞吞作用与胞饮作用等。分布在微绒毛中的微丝还可引起微绒毛伸缩和摆动。在肌肉细胞中则参与构成细肌丝，与主要由肌球蛋白组成的粗肌丝一起实现肌肉细胞的收缩功能。微丝染色液(R250法)在染色过程中由于微观结构不稳定，有些纤维在光学显微镜下无法辨认，因此能够看到的纤维主要是由微丝组成的应力纤维。微丝染色液(R250法)主要显示由微丝构成的应力纤维，由于细胞对细胞基质的附着和维持扁平铺展的形状，该纤维在体外培养的贴壁细胞中尤其发达。

    操作步骤：

    1、取材：用去离子水稀释PBSbuffer(*10)至1*。轻轻撕取约1厘米洋葱鳞茎内皮，孵育，使其下沉。

    2、抽提：弃PBSbuffer，加入TMbuffer，盖上称量瓶盖子37℃处理。

    3、漂洗：弃TMbuffer，用去离子水稀释Mbuffer(3×)至1×，用1×Mbuffer清洗。

    4、固定：稍微晾干，加入Microfilamentfluid固定细胞。

    5、冲洗：弃Microfilamentfluid，用1×Mbuffer清洗。

    6、染色：弃PBSbuffer，把盖玻片立于吸水滤纸上吸去边缘水分，加入R250stainingsolution染色。

    7、去离子水冲洗染液，标本铺在载玻片上，加盖玻片，镜检。

    注意事项：

    动物细胞微丝微丝染色液(R250法)染色时，向称量瓶中加入试剂应缓慢，避免直接滴到玻片或样本上；清洗细胞动作应轻柔，避免细胞脱落。