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远慕生物为您介绍:抗体纯化方法

发布时间:2018-08-07 13:19 点击次数:

     制备出效价高,特异性强,稳定性好的抗体是免疫学实验取得成功的基础,抗体质量的好坏直接影响着研究者研究的成败,不同的免疫学实验方法(如ELISA,IHC,IP,ICC,SDS-PAGE, WB等)对抗体的效价,浓度和纯度有不同的要求。我们知道,一般免疫血清中含有特异性抗体和非特异性抗体,血清蛋白以及其他各种杂蛋白等,在制备特异性抗体过程中当抗体的效价达到实验预期之后,我们所制备的抗体的纯度关键取决于所选择的纯化方法。下面就一一介绍常用抗体纯化方法及其相关原理。
 
1.盐析法(饱和硫酸铵沉淀法)
   该纯化方法是基于在待纯化免疫血清中加入饱和硫酸铵溶液,由于抗体也是一种蛋白质,其在水溶液中的溶解度是由其本身携带的亲水基团数和电荷数决定的,当我们向抗血清中加入饱和硫酸铵溶液后,硫酸根离子和铵根离子与抗体竞争溶液中的水分子,因为硫酸根离子和铵根离子与抗体分子相比,具有更强的亲水性,因此抗体分子表面的水化膜被破坏,同时其暴露出来的带电基团被溶液中的盐离子所中和进而导致其溶解度大大降低,依据此原理从而将其从抗血清中分离。
 
具体实验步骤如下:
 将5ml抗血清与0.01M PBS在离心管内等体积混合,向其中加入10ml饱和硫酸铵溶液,边滴加边摇匀,然后置于2到8摄氏度静置过夜。
 将步骤a中的待分离物于离心机内离心,8000r/min离心15到20分钟,除上清。
 将步骤b中离心后的沉淀用2ml 0.01M PBS 溶解,然后缓慢加入3ml 饱和硫酸铵溶液,边滴加边摇匀,然后置于2到8摄氏度静置2小时。
 将步骤c中的待分离物于离心机内离心,8000r/min离心15到20分钟,除上清。
 将步骤d中离心后的沉淀用1.65ml 0.01M PBS 溶解,然后缓慢加入3.35ml 饱和硫酸铵溶液,边滴加边摇匀,然后置于2到8摄氏度静置2小时。
 将步骤e中的待分离物于离心机内离心,8000r/min离心15到20分钟,除上清。
 将步骤f中离心后的沉淀用1ml 0.01M PBS 溶解, 转移到MD 14000透析袋内,用0.01 M PBS进行透析,透析4次以上,每次至少1小时以上。
 
2.正辛酸-饱和硫酸铵沉淀法
该纯化方法原理是:正辛酸在偏酸条件下,能与抗血清中或者小鼠腹水中的杂蛋白结合,在等电点附近将其沉淀,IgG类抗体则存在于上清液中,再利用饱和硫酸铵沉淀法即可进一步提纯。
 
具体实验步骤如下:
 将抗血清或者小鼠腹水于离心机中离心15到20分钟,8000r/min,以去除其中的细胞碎片或者其他沉淀物等杂质。
 将1体积的抗血清或者腹水与2体积的0.06M PH 4.8的醋酸盐缓冲液进行混合,室温下,边搅拌边缓慢加入正辛酸,加入正辛酸的量为33ul/ml抗血清或者腹水。
 室温混合15到30min
 2到8摄氏度静置过夜,使其充分沉淀。
  8000r/min离心15到20分钟,弃去沉淀取上清。
 将上清转移到MD 14000透析袋内,用0.01 M PBS进行透析,透析4次以上,每次至少1小时以上。
 利用盐析法(饱和硫酸铵沉淀法)对步骤f中透析后的上清进行纯化,具体实验见上,此处不再赘述。
 
3.Protein Aprotein G纯化法
基本原理:protein A和proteiin G 可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合。Protein A和protein G 作为配基可以被偶联到琼脂糖凝胶上,当抗血清从中流过时,特异性的IgG就与配基结合,其他杂蛋白则穿流而过。因两种蛋白纯化抗体时对不同宿主的抗体的结合能力不同,我们需要具体情况具体对待,分别选择protein A 或者protein G,或者是protein A/protein G组合。一般推荐小鼠单抗IgG2a,IgG2b,IgG3,兔,人,猪的多克隆抗体用protein A纯化,而小鼠单抗IgG1, 大鼠单抗,小鼠,大鼠,山羊的多克隆抗体则选择用protein G纯化。
 
具体实验步骤如下:
 称取经CNBr活化了的sepharose 4B 0.5g, 溶于2mM的HCL溶液中,4摄氏度过夜,使其充分溶胀。
 将溶胀好了的sepharose 4B预装于层析柱中,用10倍体积的2mM HCL溶液洗涤三次后用0.1 M NaHCO3 溶液对柱子进行平衡
 将5mg protein A/G 溶于0.1 M NaHCO3溶液中,加入步骤b中已平衡好的柱子,置于摇床上轻轻混合2到8摄氏度过夜或者室温2到4小时
 用0.1 M NaHCO3 溶液洗涤c中已经结合了蛋白的柱子三次。事先留取已经结合过了的上清,用紫外可见分光光度计测定结合后上清中蛋白的浓度,以确定结合率。
 用0.01M tris base 平衡柱子三次,加入0.5% BSA封闭sepharose 4B上未结合的位点,置于摇床上在室温反应2到4小时。
 用0.01M tris base 平衡柱子3次。
 加入要纯化的经预处理了的抗血清5ml,置于摇床上在室温反应2到4小时.
 用0.01M tris base 洗涤柱子三次以上,洗掉未结合的杂蛋白
 用9ml 0.1 M PH 2.5甘氨酸洗脱结合在柱子上的抗体
 将1ml 1M NaHCO3溶液加入EP管中中和步骤i中洗脱的抗体
 将步骤j中的抗体溶液装入透析袋经PEG20000或者蔗糖浓缩至2ml后于0.01M PBS中透析4次以上,每次换液间隔时间为1小时以上。
 将透析好了的抗体用紫外可见分光光度计测定其在波长280nm处的吸光值,用吸光值除以1.35即为所测抗体的浓度
 将所纯化的抗体加入30%-50%的甘油置于-20摄氏度或者-80摄氏度即可长期保存。
 
 
4.免疫亲和纯化法
基本原理:将抗原作为一种配基偶联在sepharose 4B上,血清等生物液体中的特异性抗体与sepharose 4B上的抗原进行特异性结合,其他杂蛋白和杂抗体则不被结合,通过洗涤和洗脱等一系列实验步骤即可得到高纯度的目标抗体。本方法虽然和Protein A/G均被称为亲和纯化方法,但是纯化得到的最终的抗体还是有很大区别的,Protein A/G纯化得到的主要是非特异性的IgG类抗体,而本方法纯化得到的主要是特异性的IgG类抗体,与其他纯化方法相比,本方法纯化得到的抗体其特异性最强,纯度最高。本纯化方法的实验步骤与protein A/G纯化方法基本一致,将实验方法三的配基protein A/G换成相应的目标抗原即可。
 
 
随着生物下游加工技术的不断发展,各种生物大分子特别是抗体大分子的分离纯化方法也越来越多,比如分子筛层析(凝胶层析或凝胶过滤),离子交换层析等等也在实验中被用到。以上介绍的只是一般IgG类抗体的纯化方法,其他IgM,IgA,IgD,IgE等抗体的纯化方法要依据各自性质的不同选择符合其自身特点的纯化方法。