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PCR技术原理与PCR条件对反应的影响
人阅读 发布时间：2016-10-08 11:30
PCR技术原理
PCR（PolymeraseChainReaction）：又称聚合酶链式反应，其基本原理是酶促DNA合成反应，即在模板DNA、因为和脱氧核糖核酸存在下，在耐热DNA聚合酶作用下，经过DNA链热变性、引物退火和引物延伸三个步骤，循环往复，使DNA片段在短时间内迅速扩增。它具有特异、敏感、高产率、快速、简便、重复性好、自动化等突出特点，在分子生物学和医学领域迅速得到广泛应用。
PCR条件对应的影响
变性温度与时间
模板变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，从而减少产量。变性温度太高，又会影响酶的活性。一般情况下可设为94℃20-30s，高温变性温度不宜超过95℃。
退火温度与时间
退火温度决定PCR特异性与产量。温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。合适的退火温度一般在45-68℃之间。设置特定反应的最适退火温度，可根据引物的（G+C）%含量进行推测，一般实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5℃，退火时间一般为30-60s，足以使引物与模板之间完全结合。
引物
引物与模板错配对的长度应至少为17个核苷酸，最高不宜超过30个核苷酸，最佳长度为20-24个核苷酸，如需插入酶切位点，应在酶切位点5’端加保护碱基，有利于酶切。引物的（G+C）%含量应尽量相近。引物内部应避免形成明显二级结构，如发夹结构。两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端的延伸。人工合成的引物需经色谱层析或PAGE纯化以除去未能合成至全长的短链杂质。引物的终浓度一般为0.1-1μM，浓度太高会导致非特异性扩增，浓度太低则扩增产物太少。
酶量
50μl反应体系可用0.5-5U酶，酶量的选择与模板DNA的量、扩增片段大小等有关，酶量过多易发生非特异性反应，而且可能增加突变机率，尤其在进行高保真扩增时，尽量减少酶量，但酶量过少时反应性能会下降。
延伸温度与时间
PCR反应的延伸温度一般选择70-75℃之间，延伸时间根据所选聚合酶扩增速度和扩增片段大小设定，如同样扩增2kb片段，使用Taq酶只需1min，使用高保真酶则需2min以上。延伸时间过长会导致非特异性扩增，时间太短则可能得不到扩增产物或得到一些短的非特异性片段。
循环次数
可根据模板的量，扩增片段的大小和扩增产物的下游应用等因素，设定30-40个循环。循环次数太少，扩增量不足，如果循环次数太多，错配机率会增加，非特异性背景严重。所以在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数。
模板
模板可以是单链DNA也可以是双链DNA，质粒DNA的扩增效率略低于线状DNA。模板加量一般不需太多，不超过1μg为宜，因为模板量过多可能导致非特异性扩增增加，但同时要考虑模板中靶序列的含量。
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