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上海远慕生物科技有限公司
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上海 嘉定区
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试剂、抗体、细胞库 / 细胞培养、ELISA 试剂盒、技术服务、耗材、书籍 / 软件、论文服务、原辅料包材、医疗器械、体外诊断
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公司新闻/正文
实时荧光定量PCR（realtime PCR）
人阅读 发布时间：2015-11-23 10:02
摘要 : 不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法，因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较高，所以，正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法，在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。
远慕生物新一轮特价生物试剂促销开始！
一、RNA的提取(详见RNA提取及反转录)
不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法，因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较高，所以，正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法，在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。
在总rna的提取过程中，注意避免mRNA的断裂;取2ug进行RNA的甲醛变性胶电泳检测，如果存在DNA污染时，要用DNase I进行消化(因为在处理过程中RNA极易降解，建议体系中加入适量RNA酶抑制剂)。
二、DNAse I 消化样品RNA 中的DNA
用DNase I 消化DNA
组份 加量
模板(RNA) 10ug
RNase Inhibitor 4ul
DNase I buffer 10ul
DNase I 10ul
DEPC处理H2O 至100ul
混匀，37℃ 90min
三、RNA琼脂糖凝胶电泳
1.1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制：
1) 称取琼脂糖0.45g放入三角瓶中，向其中加入4.5ml的10×MOPS缓冲液和39.5ml的DEPC水，放微波炉里溶化。
2) 待冷却到60摄氏度左右时，加入1ml甲醛，摇匀(避免产生气泡)。倒入凝胶板上凝固30min。
2.取各个RNA样品4µl，加入6×RNA电泳上样缓冲液2µl混匀，加入变性胶加样孔中。
3.120V电压下电泳25min。用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。
4.RNA电泳结果如下图所示。可见28S和18S两条明亮条带，无DNA条带污染。
实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）实验流程
四.RNA反转录为cDNA
反转录程序(以MBI的M-MLV为例)
组份 加量(20ul体系) 加量(40ul体系)
模板(RNA) 0.1~2.5ug(根据条带的亮度适当调整) 3ug(根据条带的亮度适当调整)
引物T18(50uM)(或其他引物) 2.0ul 4.0ul
DEPC处理H2O 至12.5ul 至25ul
混匀，70℃ 5min，立即冰浴
5*buffer 4.0ul 8.0ul
dNTP(10mM) 2.0ul 4.0ul
RNase Inhibitor 0.5ul 1.0ul
混匀，37℃ 5min
M-MLV 1.0ul 2.0ul
42℃ 60min ，70℃ 10min
反转录引物的选择与Real-Time PCR引物设计的要求
1)随机六聚体引物：
当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。
2)Oligo(dT)：
是一种仅对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3'端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA只占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。特别适合检测多个基因的表达，这样可以节约反转录的试剂，cDNA可以多次使用，可用于检测稀有基因是否表达、从极少量细胞中定量检测特定mRNA的表达水平。
3)特异性引物：
最特异的反转录方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。
做 Real Time PCR时，用于SYBR Green I/Eva Green 法时的一对引物与一般PCR的引物，在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：
① Tm=55-65℃
② GC=30-80%
③ PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-300bp之间都可。
④ 引物的退火温度要高，一般要在 60℃以上。
要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。
至于设计软件，PRIMER3，PRIMER5，PRIMER EXPRESS都应该可以的。做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不易。
五、cDNA与引物质量检测
取0.2ml薄壁PCR管，编号。向各管中加入含染料2×PCR TaqMix10ul;加入正反向引物各0.5ul(引物浓度10uM) ，向管中加入混合的cDNA各1ul。各管补加水至20ul。
组份 加量
2×PCRTaqMix 10ul
10uMPrimer FW 0.5ul
10uMPrimer RV 0.5ul
Template DNA 1ul
ddH2O 混匀至20ul
混匀，置于TP600PCR仪中。95℃ 5min;95℃15s，60℃35s ，40cycles;72℃ 5min;4℃ pause。
取扩增产物各8μl，DL2000 分子量标准5μl/泳道。1%琼脂糖凝胶120V电压下电泳25min。用凝胶紫外分析仪观察。
选择特异性好，扩增效率高的引物作为实时荧光使用引物。
六、利用相对定量的方法分析目的基因表达量的情况：
由于RNA纯化后得率不同、RNA反转录为cDNA的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同，因此，在进行基因表达调控研究中都会用一些看家基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。常用的看家基因有beta-actin，GAPDH，18SrRNA等。因此，在做基因表达调控分析时至少要做两个基因，目的基因和一个看家基因。
七、定量 PCR检测：
取0.2ml薄壁PCR管，分别编号。向各管中加入2×qPCR TaqMix12.5ul，10uM各基因正反向引物混合物0.5ul，对应的cDNA各1ul。一管中不加模板用作阴性对照。各管补加水至25ul。
组份 加量
模板(cDNA)/ddH2O 1.0ul
10uM 引物F/R 0.5ul
2×qPCR Mix 12.5ul
ddH2O 11.0ul
混匀，置于SLAN荧光定量PCR仪中。95℃5min预变性后，95℃15s→65℃35s(荧光检测)，40cycles。荧光定量PCR一般把退火和扩增设成一个温度，只在扩增出现问题时才会考虑设梯度。
八、扩增曲线和溶解曲线
实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）实验流程
一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期，其形状是一条平滑的S型曲线。
如果在荧光背景信号阶段出现很多拐点，可能的原因是体系未混匀或者存在固态杂质;
如果向下探头后又很快抬头然后又向下探头，可能原因是体系中模板量太高，建议模板稀释后再用。
如果引物二聚体存在则阴性对照会出现抬头现象，这在Real-Time PCR中很难避免;
若是阴性对照的溶解曲线出现和样品中同样的峰，说明体系配置中存在污染，则实验结果不可用。
在溶解曲线中出现双峰有三种可能：
① 引物峰，引物峰通常是两峰中的前面一个，消除的办法是降低体系中的引物量或重新设计引物;
② 在做基因表达差异时容易出现DNA被扩增峰(只在引物跨内含子时存在)，出现原因是提取RNA时存在DNA污染，可以通过电泳验证，这时要重新消化RNA样品中的DNA;
③ 扩增非特异，这时要重新摸扩增条件或重新设计并验证引物。
九、表达差异的计算方法
绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数;相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本或是目标转录本在不同时相的表达差异之间的表达差异。
2-△△CT方法是实时定量PCR实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法。
在有些情况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异即可。显然，我们说X基因在经过某种处理后表达量增加2.5倍比说该基因的表达从1000 拷贝/细胞增加到2500拷贝/细胞更加直观。
2-△△CT方法的推导(详见实时定量PCR和2-△△CT法分析基因相对表达量)
补充：在DNase I 消化样品RNA 中的DNA后，需要对样品重新进行氯仿抽提，具体实验流程如下：
消化后总体积10Oul，体积太少，不利于抽提，我们往往补加200ulDEPC水。
1. 向离心管中加入等体积氯仿(约300ul) ，剧烈颠倒，充分混匀至中层出现白色片状沉淀。4℃14000 rpm离心8min，取上清(约250ul)。
2. 加入1/10体积的NaAC(3M)(约25ul)和预冷的等体积异丙醇(约280ul)，-20℃放置20min。
3. 4℃14000 rpm离心15min，去上清，注意不要触到沉淀。
4. 加入1ml的75%乙醇，4℃14000rpm离心3min，去上清。
5. 瞬时离心，用200ul(或10ul)的枪头小心吸去离心管底的残存液态(勿吸到管底的沉淀)。
6. 把离心管放置于超净台晾至约5-10 分钟(勿完全干燥，否则很难溶)。加入30~50μl的无RNase的水，静止1min 后，振荡30sec，瞬时离心。
7. 将提取的RNA立即进行下游实验，或放-20℃保存。
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一、RNA的提取(详见RNA提取及反转录)
不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法，因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较高，所以，正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法，在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。
在总rna的提取过程中，注意避免mRNA的断裂;取2ug进行RNA的甲醛变性胶电泳检测，如果存在DNA污染时，要用DNase I进行消化(因为在处理过程中RNA极易降解，建议体系中加入适量RNA酶抑制剂)。
二、DNAse I 消化样品RNA 中的DNA
用DNase I 消化DNA
组份 加量
模板(RNA) 10ug
RNase Inhibitor 4ul
DNase I buffer 10ul
DNase I 10ul
DEPC处理H2O 至100ul
混匀，37℃ 90min
三、RNA琼脂糖凝胶电泳
1.1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制：
1) 称取琼脂糖0.45g放入三角瓶中，向其中加入4.5ml的10×MOPS缓冲液和39.5ml的DEPC水，放微波炉里溶化。
2) 待冷却到60摄氏度左右时，加入1ml甲醛，摇匀(避免产生气泡)。倒入凝胶板上凝固30min。
2.取各个RNA样品4µl，加入6×RNA电泳上样缓冲液2µl混匀，加入变性胶加样孔中。
3.120V电压下电泳25min。用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。
4.RNA电泳结果如下图所示。可见28S和18S两条明亮条带，无DNA条带污染。
实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）实验流程
四.RNA反转录为cDNA
反转录程序(以MBI的M-MLV为例)
组份 加量(20ul体系) 加量(40ul体系)
模板(RNA) 0.1~2.5ug(根据条带的亮度适当调整) 3ug(根据条带的亮度适当调整)
引物T18(50uM)(或其他引物) 2.0ul 4.0ul
DEPC处理H2O 至12.5ul 至25ul
混匀，70℃ 5min，立即冰浴
5*buffer 4.0ul 8.0ul
dNTP(10mM) 2.0ul 4.0ul
RNase Inhibitor 0.5ul 1.0ul
混匀，37℃ 5min
M-MLV 1.0ul 2.0ul
42℃ 60min ，70℃ 10min
反转录引物的选择与Real-Time PCR引物设计的要求
1)随机六聚体引物：
当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。
2)Oligo(dT)：
是一种仅对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3'端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA只占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。特别适合检测多个基因的表达，这样可以节约反转录的试剂，cDNA可以多次使用，可用于检测稀有基因是否表达、从极少量细胞中定量检测特定mRNA的表达水平。
3)特异性引物：
最特异的反转录方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。
做 Real Time PCR时，用于SYBR Green I/Eva Green 法时的一对引物与一般PCR的引物，在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：
① Tm=55-65℃
② GC=30-80%
③ PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-300bp之间都可。
④ 引物的退火温度要高，一般要在 60℃以上。
要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。
至于设计软件，PRIMER3，PRIMER5，PRIMER EXPRESS都应该可以的。做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不易。
五、cDNA与引物质量检测
取0.2ml薄壁PCR管，编号。向各管中加入含染料2×PCR TaqMix10ul;加入正反向引物各0.5ul(引物浓度10uM) ，向管中加入混合的cDNA各1ul。各管补加水至20ul。
组份 加量
2×PCRTaqMix 10ul
10uMPrimer FW 0.5ul
10uMPrimer RV 0.5ul
Template DNA 1ul
ddH2O 混匀至20ul
混匀，置于TP600PCR仪中。95℃ 5min;95℃15s，60℃35s ，40cycles;72℃ 5min;4℃ pause。
取扩增产物各8μl，DL2000 分子量标准5μl/泳道。1%琼脂糖凝胶120V电压下电泳25min。用凝胶紫外分析仪观察。
选择特异性好，扩增效率高的引物作为实时荧光使用引物。
六、利用相对定量的方法分析目的基因表达量的情况：
由于RNA纯化后得率不同、RNA反转录为cDNA的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同，因此，在进行基因表达调控研究中都会用一些看家基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。常用的看家基因有beta-actin，GAPDH，18SrRNA等。因此，在做基因表达调控分析时至少要做两个基因，目的基因和一个看家基因。
七、定量 PCR检测：
取0.2ml薄壁PCR管，分别编号。向各管中加入2×qPCR TaqMix12.5ul，10uM各基因正反向引物混合物0.5ul，对应的cDNA各1ul。一管中不加模板用作阴性对照。各管补加水至25ul。
组份 加量
模板(cDNA)/ddH2O 1.0ul
10uM 引物F/R 0.5ul
2×qPCR Mix 12.5ul
ddH2O 11.0ul
混匀，置于SLAN荧光定量PCR仪中。95℃5min预变性后，95℃15s→65℃35s(荧光检测)，40cycles。荧光定量PCR一般把退火和扩增设成一个温度，只在扩增出现问题时才会考虑设梯度。
八、扩增曲线和溶解曲线
实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）实验流程
一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期，其形状是一条平滑的S型曲线。
如果在荧光背景信号阶段出现很多拐点，可能的原因是体系未混匀或者存在固态杂质;
如果向下探头后又很快抬头然后又向下探头，可能原因是体系中模板量太高，建议模板稀释后再用。
如果引物二聚体存在则阴性对照会出现抬头现象，这在Real-Time PCR中很难避免;
若是阴性对照的溶解曲线出现和样品中同样的峰，说明体系配置中存在污染，则实验结果不可用。
在溶解曲线中出现双峰有三种可能：
① 引物峰，引物峰通常是两峰中的前面一个，消除的办法是降低体系中的引物量或重新设计引物;
② 在做基因表达差异时容易出现DNA被扩增峰(只在引物跨内含子时存在)，出现原因是提取RNA时存在DNA污染，可以通过电泳验证，这时要重新消化RNA样品中的DNA;
③ 扩增非特异，这时要重新摸扩增条件或重新设计并验证引物。
九、表达差异的计算方法
绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数;相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本或是目标转录本在不同时相的表达差异之间的表达差异。
2-△△CT方法是实时定量PCR实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法。
在有些情况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异即可。显然，我们说X基因在经过某种处理后表达量增加2.5倍比说该基因的表达从1000 拷贝/细胞增加到2500拷贝/细胞更加直观。
2-△△CT方法的推导(详见实时定量PCR和2-△△CT法分析基因相对表达量)
补充：在DNase I 消化样品RNA 中的DNA后，需要对样品重新进行氯仿抽提，具体实验流程如下：
消化后总体积10Oul，体积太少，不利于抽提，我们往往补加200ulDEPC水。
1. 向离心管中加入等体积氯仿(约300ul) ，剧烈颠倒，充分混匀至中层出现白色片状沉淀。4℃14000 rpm离心8min，取上清(约250ul)。
2. 加入1/10体积的NaAC(3M)(约25ul)和预冷的等体积异丙醇(约280ul)，-20℃放置20min。
3. 4℃14000 rpm离心15min，去上清，注意不要触到沉淀。
4. 加入1ml的75%乙醇，4℃14000rpm离心3min，去上清。
5. 瞬时离心，用200ul(或10ul)的枪头小心吸去离心管底的残存液态(勿吸到管底的沉淀)。
6. 把离心管放置于超净台晾至约5-10 分钟(勿完全干燥，否则很难溶)。加入30~50μl的无RNase的水，静止1min 后，振荡30sec，瞬时离心。
7. 将提取的RNA立即进行下游实验，或放-20℃保存。
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