TUNEL 法测凋亡操作步骤       
一、TUNEL检测原理
      TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒是采用非同位素方法来检测细胞在凋亡过程中DNA 的断裂情况，可在原位快速准确地检测单个凋亡细胞。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）的凋亡原位检测。
     其原理是细胞凋亡发生时，内源性核酸酶激活，使DNA的双链断裂或一条链出现缺口，产生一系列3’-OH末端，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）作用下，组织细胞原位DNA切口可被标记上生物素-dUTP，即TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling），可与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，显示为棕色（过氧化物酶活性），特异准确地定位正在凋亡的细胞，在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正的或正在增殖的细胞几乎没有DNA 的断裂，因而没有3'-OH 形成，很少能够被染色。

参照图


二、试剂盒组份
       组   份                                           10 assays             25 assays               储存条件
A：Equilibration Buffer                           1.0 mL                  2.5 mL                    -20 ℃          
B：Biotinylated Nucleotide Mix               10 μL                    25 μL                     -20 ℃
C：TdT Enzyme                                    10 μL                    25 μL                     -20 ℃          
D：500×Proteinase K                           10 μL                    25 μL                     -20 ℃
       20×SSC                                       15 mL                   38 mL                     4 ℃
E：Streptavidin-HRP                              10 μL                   25 μL                       4 ℃
F：20×DAB Substrate Buffer                 50 μL                  125 μL                      4 ℃           
G：20×DAB Chromogen                       50 μL                  125 μL                      4 ℃
H：20×Hydrogen Peroxide                    50 μL                  125 μL                      4 ℃
三、操作流程
1.操作流程概览
 
2.细胞样本制备
准备：
    ● PBS：8.0g NaCl， 0.2 g KCl， 1.44g Na2HPO4，0.24g KH2PO4，溶于800ml去离子水中，HCl调pH至7.4，加水定容至1L。
    ● 固定液：4%多聚甲醛溶于pH7.4的PBS中，新鲜配制；
    ● 封闭液：3%H2O2溶于甲醇；
    ● 细胞膜通透液：0.1%TritonX-100溶于PBS，新鲜配制；
操作步骤：
1)经过实验处理的细胞爬片或细胞涂片，自然晾干；
2)室温固定15min~30min；PBS漂洗3×5min；
3)浸入封闭液中，室温封闭10min；PBS漂洗3×5min；
4)浸入细胞膜通透液中，室温30sec~2min；
5)进行标记反应。
3.石蜡包埋组织切片预处理
准备：
    ● 石蜡切片脱蜡至水：二甲苯脱蜡2×10min，梯度乙醇水合（100%、95%、90%、80%、70%）；
    ● 蛋白酶K工作液：2 μL500×蛋白酶K + 998 μL PBS；
    ● 固定液：4%多聚甲醛溶于pH7.4的PBS中，新鲜配制；
    ● 封闭液：3%H2O2溶于甲醇。
操作步骤：
1)石蜡包埋的组织切片按常规方法脱蜡至水；
2)PBS漂洗3×5min；
3)加入蛋白酶K工作液，37℃反应15~30min；PBS漂洗3×5min；
4)（选择进行）室温固定15min~30min；PBS漂洗3×5min；
5)浸入封闭液中，室温封闭10min，PBS漂洗3×5min；
6)进行标记反应。
4.冰冻组织切片预处理
准备：
    ● 固定液：4%多聚甲醛溶于pH7.4的PBS中，新鲜配制；
    ● 封闭液：3%H2O2溶于甲醇；
    ● 细胞膜通透液：0.1%TritonX-100溶于PBS，新鲜配制；
操作步骤：
1)冰冻切片浸入固定液，室温固定10min；PBS漂洗3×5min；
2)浸入封闭液中，室温封闭10min；PBS漂洗3×5min；
3)浸入通透液中，室温30sec~2min；
4)进行标记反应。
5.阳性对照和阴性对照的准备
TUNEL检测时需要设立阳性对照和阴性对照，以显示实验的客观性和准确性。
1)阳性对照样本的处理（选择进行）
   DNaseI反应液（用户自备）： （10U-3000U DNase I；40mM Tris-HCl pH 7.9； 
                                                   10 mM NaCl；6mM MgCl2；10mM CaCl2）
组织样本经过蛋白酶K处理或者通透液处理，PBS浸洗后，加入100 μL DNaseI反应液，室温孵育10~30min，用去离子水彻底清洗玻片，浸入PBS漂洗5min，进行标记反应。
2)阴性对照样本的处理
   在进行标记反应过程配制TdT酶反应液时，不加入TdT酶，其余步骤相同。
四、标记和显色反应
以下操作在湿盒内进行。
1.预处理好的样本经过PBS漂洗后，用滤纸轻轻吸去样本周围液体；
2.每个样本滴加100 μL TdT酶反应液，于37＆#61616;C避光反应60min；
TdT酶反应液的准备（即用即配）：
  成分                                        标准100 μL/片        切片数        总体积
  Equilibration Buffer                    98 μL                     ×                =
  Biotinylated Nucleotide Mix        1 μL                      ×                =
  TdT Enzyme                             1 μL                      ×                =
阴性对照片不加TdT酶。
3.用去离子水按1：10稀释20×SSC，进行终止反应，室温15min；然后PBS漂洗3×5min；
4.浸入0.3%H2O2/PBS中封闭内源性过氧化物酶活性，室温孵育3~5min；PBS漂洗3×5min；
5.滴加100 μL Streptavidin-HRP工作液（按1：500稀释为工作液），于37℃反应30~60min；
6.PBS漂洗3×5min；
7.滴加DAB显色液：
  成分                                         100 μL/片       切片数     总体积
  20×DAB Substrate Buffer             5                   ×             =
  20×DAB Chromogen                    5                   ×            =
  20×Hydrogen Peroxide                 5                  ×            =
  ddH2O                                        85                  ×            =
8.用去离子水漂洗数次；（选择进行复染细胞核）；
9.中性树胶封片，显微镜下观察。
注意事项：
1.PBS清洗后，请尽量去除PBS液体再进行下一步反应；
2.避免载波片上的样本干燥造成实验失败；
3.TdT酶反应液应即用即配，在冰上进行，不宜长期保存；
4.复染细胞核可以用甲基绿染液（用户自备）。