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上海远慕生物科技有限公司
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荧光原位杂交(FISH)的实验步骤
人阅读 发布时间:2016-12-28 10:08
FISH(Fluorescence In-Situ Hybridization)技术问世于 20 世纪 70 年代后期,是在原来的同位素原位杂交技术基础上发展起来的。其基本原理是,按照两个核酸的碱基序列互 补原则,用特殊修饰的核苷酸分子标记 DNA 探针,然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或 DNA 纤维切片上,再与荧光素分子偶联的单克隆抗体和探针分子特异性结合,经荧光检测系统和图形分析技术对染色体或 DNA 纤维上的 DNA 序列定位、定性和相对定量。实验方法如下:
1)玻片处理
(a)玻片清洗:热肥皂水刷洗,1% 盐酸浸泡 24 h,再在 0.1% 焦炭酸二乙酯(DEPC)中浸泡 24 h。
(b)硅化处理:玻片和盖玻片 1%(质量分数)盐酸煮沸 10 min,烘干,锡纸包好 4 ℃ 保存备用。
(c)明胶涂片制备:将烘干的玻片放入明胶中 10 min,然后 60 ℃ 烘干过夜备用。
(d)试剂瓶、塑料器皿及组织匀浆器的处理试剂瓶、组织匀浆器先清洗干净,用 1 mL/LDEPC(Diethyl Pyrocarbonate)水溶液浸泡处理(37 ℃、2 h,室温过夜),高压消毒去除 DEPC,然后 250 ℃ 烘干 4 h 以上或 200 ℃ 过夜。称量试剂勺也要干烤。塑料器皿最好用灭菌的一次性塑料用品,使用前进行高压消毒。为保证质量,凡使用的枪头、试管等均经 0. 5 mL/L DEPC 水溶液处理 3 h 以上,然后再高压灭菌,烘干。若为进口已处理的无 RNase 和 DNase 的枪头、试管可不必处理直接使用。
参照图
2)样品制备及其所涉及的试剂包括:
(a)缓冲溶液:
1 × PBS 缓冲溶液:NaCl 8 g,Na2 HPO4 2.9 g,KCl 0.2 g,KH2PO4 0.2 g,溶入 1000 mL 超纯水;
3 × PBS 缓冲溶液:NaCl 24 g,Na2 HPO4 8.7 g,KCl 0.6 g,KH2PO4 0.6 g,溶入 1000 mL 超纯水;
通常配制成 10 × PBS 的储备液,3 × PBS 和 1 × PBS 可用 DEPC 水稀释获得。
(b)4% 多聚甲醛(Paraformaldehyde, PFA)
称取 2 g PFA 加入 30 ml 约 60 ℃ 的热水,滴几滴 20% NaOH 放在磁力搅拌器搅拌至完全溶解。然后向其中加入 16.5 ml 3 × PBS 缓冲液,在冰浴中充分混匀冷却,冷却后,用 HCl 调整至中性(7.2 左右),拿出搅拌子。向 PFA 溶液中加入超纯水,定容在 50 ml。用 0.45 微米的膜过滤后使用。(室温或 4 ℃ 保存备用)。
(c)配制 50%,80%,98% 无水乙醇溶液,每个总量 20 mL。
(d)DAPI 溶液
用 1 ml ddH2O 将 DAPI 溶解,制得 2.9 mM 的 DAPI 溶液(1 mg DAPI/1 mL H2O)。(DAPI 不能直接用 PBS 等缓冲液溶解,需要先用水将其溶解)。取适量 DAPI 水溶液加到 PBS 中,制备成 10~50 µM 的 DAPI 溶液。
(e)各种溶液的配制:凡是水溶性液体均用 1 mL/L DEPC 水配制。
注意:
3)取样及保存方法
(a)反应器沉淀前取样 2~5 mL 至离心管。
(b)离心 (2000 r/min)5 min,去上清液 (加蒸馏水重复两次)。
(c)样品加入 1 mL 多聚甲醛,摇匀,4 ℃ 下放置 3 h。
(d)样品离心(12000r/min)5 min,去上清夜。
(e)加入 1 × PBS,摇匀,离心(10000r/min)5 min,去上清夜 (重复 3 次)。
(f)加 0.5 mL 1 × PBS,0.5 mL 无水乙醇,摇匀,-20 ℃ 保存 (可保存 6 个月)。
4)样品固定:
稀释样品 3~5 倍,对样品进行超声处理 (3W 超声 2~3 min,沉降 1 min,去沉淀物,5W 超声 5 min),将活性污泥絮体打散成单个细胞以便于显微镜 计数。然后取 3 μL 样品涂于包埋明胶的玻片上 (检查样片本底),37 ℃ 的热烘箱固定 2 h(或者在空气中干燥 2 h 或者过夜)。依次用 50%、80%、98% (质量比)乙醇浸渍 3 min,对细胞进行脱水后,立放,并进行干燥。
5)样品杂交
实验所涉及的缓冲液包括杂交缓冲液 (Hybridization Buffer, HB)和淋洗缓冲液 (Washing Buffer, WB),其组分如表 1-1 和表 1-2。
表 1-1 杂交缓冲液(Hybridization Buffer)
表 1-2 淋洗缓冲液(Washing Buffer)
(a)吸取 2 mL 杂交缓冲液遍布在杂交盒内折好的吸水纸上,将已固定好样品的载玻片放入杂交管中,然后在 46 ℃ 杂交炉中放置数分钟。
(b)吸取 10 μL 探针贮存液和 80 μL 杂交缓冲液混合后,用箔纸包好放入 46 ℃ 杂交炉中预热数分钟;探针贮存液浓度为 25 ng/μL,用无菌水稀释购买的探针,实验用的探针序列及杂交条件见表 1-3 所示。
表 1-3 用于检测样品中 AOX、NOX 的寡核苷酸探针及杂交条件
注:
(a)表示杂交缓冲液中去离子甲酰胺浓度(%)
(c)吸取 9 μL 预热后的探针稀释液涂于载玻片待测样品上,然后将载玻片迅速地移回杂交管中于 46 ℃ 下进行杂交(黑暗中进行),杂交时间为 2~3 h;
(d)杂交后的洗脱:打开恒温水浴槽,加热到 48 ℃,对杂交缓冲液、淋洗缓冲液进行预热。杂交盒中取出载玻片用杂交缓冲液冲洗样品后,快速放入淋洗缓冲液,48 ℃ 水浴 20 min 后用 4 ℃ 冰水,冲洗样品,样品洁净台中挥干。
DAPI 染色
每孔滴 9 uL DAPI,4 ℃ 暗处 5 min,4 ℃ 冰水(BPS 缓冲溶液)冲洗,挥干。用带有 360 nm 激发波长,460 nm 发射波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞。DAPI(4,6-diamido-2-phenylindole)染色用于全细胞计数。
封片
涂封片剂,盖盖玻片,无气泡后指甲油封装。
荧光显微镜进行检测
每个样品及每个探针都采集 20 个不同区域。每个区域中的细胞个数要超过 1000 个,然后进行平均以获得每个探针对于每个样品的杂交结果。细菌丰度或细菌数 目(cells/g 或 cells/L)为 AS1/(S2V),其中 A 为视野中细菌平均数;S1 为样品涂抹面积;S2 为视野涂抹面积;V 为样品体积。
1)玻片处理
(a)玻片清洗:热肥皂水刷洗,1% 盐酸浸泡 24 h,再在 0.1% 焦炭酸二乙酯(DEPC)中浸泡 24 h。
(b)硅化处理:玻片和盖玻片 1%(质量分数)盐酸煮沸 10 min,烘干,锡纸包好 4 ℃ 保存备用。
(c)明胶涂片制备:将烘干的玻片放入明胶中 10 min,然后 60 ℃ 烘干过夜备用。
(d)试剂瓶、塑料器皿及组织匀浆器的处理试剂瓶、组织匀浆器先清洗干净,用 1 mL/LDEPC(Diethyl Pyrocarbonate)水溶液浸泡处理(37 ℃、2 h,室温过夜),高压消毒去除 DEPC,然后 250 ℃ 烘干 4 h 以上或 200 ℃ 过夜。称量试剂勺也要干烤。塑料器皿最好用灭菌的一次性塑料用品,使用前进行高压消毒。为保证质量,凡使用的枪头、试管等均经 0. 5 mL/L DEPC 水溶液处理 3 h 以上,然后再高压灭菌,烘干。若为进口已处理的无 RNase 和 DNase 的枪头、试管可不必处理直接使用。
参照图
2)样品制备及其所涉及的试剂包括:
(a)缓冲溶液:
1 × PBS 缓冲溶液:NaCl 8 g,Na2 HPO4 2.9 g,KCl 0.2 g,KH2PO4 0.2 g,溶入 1000 mL 超纯水;
3 × PBS 缓冲溶液:NaCl 24 g,Na2 HPO4 8.7 g,KCl 0.6 g,KH2PO4 0.6 g,溶入 1000 mL 超纯水;
通常配制成 10 × PBS 的储备液,3 × PBS 和 1 × PBS 可用 DEPC 水稀释获得。
(b)4% 多聚甲醛(Paraformaldehyde, PFA)
称取 2 g PFA 加入 30 ml 约 60 ℃ 的热水,滴几滴 20% NaOH 放在磁力搅拌器搅拌至完全溶解。然后向其中加入 16.5 ml 3 × PBS 缓冲液,在冰浴中充分混匀冷却,冷却后,用 HCl 调整至中性(7.2 左右),拿出搅拌子。向 PFA 溶液中加入超纯水,定容在 50 ml。用 0.45 微米的膜过滤后使用。(室温或 4 ℃ 保存备用)。
(c)配制 50%,80%,98% 无水乙醇溶液,每个总量 20 mL。
(d)DAPI 溶液
用 1 ml ddH2O 将 DAPI 溶解,制得 2.9 mM 的 DAPI 溶液(1 mg DAPI/1 mL H2O)。(DAPI 不能直接用 PBS 等缓冲液溶解,需要先用水将其溶解)。取适量 DAPI 水溶液加到 PBS 中,制备成 10~50 µM 的 DAPI 溶液。
(e)各种溶液的配制:凡是水溶性液体均用 1 mL/L DEPC 水配制。
注意:
- 配制时应在通风条件下操作,并避免接触皮肤和吸入(戴手套及口罩),因 PFA 有较强的固定作用及毒性,对粘膜及皮肤有固定及毒性,刺激作用;
- 加热时,温度不宜过高,常为 60~65 ℃,否则,PFA 降解失效;
- 配制好的 PFA 虽可存放一定时间,但过久的液体,固定效果下降,应尽早使用。
- 4% PFA 是目前原位杂交组织化学技术中最常用的固定液,它能较好地保持组织及细胞内的 RNA,同时对形态保持也较好。样品固定时间在 2~3 小时,RNA 含量较为恒定。过度延长固定时间会引起细胞内生物大分子的过度交联,影响探针的穿透力,降低杂交效率。
3)取样及保存方法
(a)反应器沉淀前取样 2~5 mL 至离心管。
(b)离心 (2000 r/min)5 min,去上清液 (加蒸馏水重复两次)。
(c)样品加入 1 mL 多聚甲醛,摇匀,4 ℃ 下放置 3 h。
(d)样品离心(12000r/min)5 min,去上清夜。
(e)加入 1 × PBS,摇匀,离心(10000r/min)5 min,去上清夜 (重复 3 次)。
(f)加 0.5 mL 1 × PBS,0.5 mL 无水乙醇,摇匀,-20 ℃ 保存 (可保存 6 个月)。
4)样品固定:
稀释样品 3~5 倍,对样品进行超声处理 (3W 超声 2~3 min,沉降 1 min,去沉淀物,5W 超声 5 min),将活性污泥絮体打散成单个细胞以便于显微镜 计数。然后取 3 μL 样品涂于包埋明胶的玻片上 (检查样片本底),37 ℃ 的热烘箱固定 2 h(或者在空气中干燥 2 h 或者过夜)。依次用 50%、80%、98% (质量比)乙醇浸渍 3 min,对细胞进行脱水后,立放,并进行干燥。
5)样品杂交
实验所涉及的缓冲液包括杂交缓冲液 (Hybridization Buffer, HB)和淋洗缓冲液 (Washing Buffer, WB),其组分如表 1-1 和表 1-2。
表 1-1 杂交缓冲液(Hybridization Buffer)
5% | 10% | 20% | 30% | 35% | 40% | |
0.05%SDS(μL) | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 |
50mMTri-HCl(μL) | 24 | 24 | 24 | 24 | 24 | 24 |
5mol NaCl(mL) | 4.32 | 4.32 | 4.32 | 4.32 | 4.32 | 4.32 |
甲酰胺(mL) | 1.2 | 2.4 | 4.8 | 7.2 | 8.4 | 9.6 |
蒸馏水(mL) | 18.4548 | 17.2548 | 14.8548 | 12.4548 | 11.2548 | 10.0548 |
探针 | Nsm156 | Ntcoc206 | Ntspn693 | Nsv443 | Ntspa662 NSO1225 Nmv | NIT3 |
表 1-2 淋洗缓冲液(Washing Buffer)
组分 | 体积 |
0.05%SDS | 0.6μL |
50m MTri-HCl | 12μL |
5mol NaCl | 2.16mL |
蒸馏水 | 42.8274mL |
(a)吸取 2 mL 杂交缓冲液遍布在杂交盒内折好的吸水纸上,将已固定好样品的载玻片放入杂交管中,然后在 46 ℃ 杂交炉中放置数分钟。
(b)吸取 10 μL 探针贮存液和 80 μL 杂交缓冲液混合后,用箔纸包好放入 46 ℃ 杂交炉中预热数分钟;探针贮存液浓度为 25 ng/μL,用无菌水稀释购买的探针,实验用的探针序列及杂交条件见表 1-3 所示。
表 1-3 用于检测样品中 AOX、NOX 的寡核苷酸探针及杂交条件
探针 | 探针序列(5’~3’) | 标记细菌种属 | 浓度a | |
NSO1225 | CGCCATTGTATTACGTGTGA | Ammonia oxidizing beta-proteobacteria | 35 | |
Nsv443 | CCGTGACCGTTTCGTTCCG | Nitroso-spira, -lobus, -vibrio | 30 | |
Nmv | TCCTCAGAGACTACGCGG | Nitroso-coccus | 35 | |
Ntspa662 | GGAATTCCGCGCTCCTCT | Nitrospira | 35 | |
NIT3 | CCTGGCTCCATGCTCCG | Nitrobacter | 40 | |
Ntcoc206 | CGGTGCGAGCTTGCAAGC | Nitrococcus mobilis | 10 | |
Ntspn693 | TTCCCAATATCAACGCATT | Nitrospina gracilis | 20 |
注:
(a)表示杂交缓冲液中去离子甲酰胺浓度(%)
(c)吸取 9 μL 预热后的探针稀释液涂于载玻片待测样品上,然后将载玻片迅速地移回杂交管中于 46 ℃ 下进行杂交(黑暗中进行),杂交时间为 2~3 h;
(d)杂交后的洗脱:打开恒温水浴槽,加热到 48 ℃,对杂交缓冲液、淋洗缓冲液进行预热。杂交盒中取出载玻片用杂交缓冲液冲洗样品后,快速放入淋洗缓冲液,48 ℃ 水浴 20 min 后用 4 ℃ 冰水,冲洗样品,样品洁净台中挥干。
DAPI 染色
每孔滴 9 uL DAPI,4 ℃ 暗处 5 min,4 ℃ 冰水(BPS 缓冲溶液)冲洗,挥干。用带有 360 nm 激发波长,460 nm 发射波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞。DAPI(4,6-diamido-2-phenylindole)染色用于全细胞计数。
封片
涂封片剂,盖盖玻片,无气泡后指甲油封装。
荧光显微镜进行检测
每个样品及每个探针都采集 20 个不同区域。每个区域中的细胞个数要超过 1000 个,然后进行平均以获得每个探针对于每个样品的杂交结果。细菌丰度或细菌数 目(cells/g 或 cells/L)为 AS1/(S2V),其中 A 为视野中细菌平均数;S1 为样品涂抹面积;S2 为视野涂抹面积;V 为样品体积。