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自然染色质免疫沉淀实验设计流程

人阅读 发布时间:2015-08-14 11:02

自然染色质免疫沉淀实验设计流程​
 
1。从培养的人细胞染色质的制备

1.1.cultured细胞(如白血病或lymphoblastoids)的种植密度约为1×106细胞/ ml直到inlog相。
1.2.harvest细胞:离心样品(7000克,10分钟,4°C)和洗细胞颗粒3×冰冷的PBS(磷酸盐缓冲生理盐水)。
它是必不可少的,5毫米丁酸钠在染色质抗体solutionsthroughout isolationwhen acetylatedhistones防止脱乙酰基本。
1.3.resuspend细胞沉淀在TBS(Tris缓冲生理盐水)在2×107个细胞/毫升,加1% V / V吐温40 intbs等量。pmsfto加入终浓度为0.5毫米。离开轻轻地搅拌在冰1hr(转移悬浮a50ml管小磁棒orflea;置管在冰上的磁力搅拌器)。
1.4.transfer细胞一种全玻璃匀浆器和均匀7ml等分七招用“a”或“紧”
杵。检查核已相contrastmicroscopy释放;完整的细胞应该有核的光环包围着中央darkregion,是较不密集的细胞质。

你可能需要增加或减少这一步的最大nucleidepending对细胞系的产量。

1.5.centrifuge样品(10000克,20分钟,4°C)。
1.6.resuspend核颗粒25%【W / V ]蔗糖/ TBS在4x106核/ml和衬底0.5卷50%【W / V ]蔗糖/ TBS;离心样品(14000克,25分钟,4°C)。
1.7.discard上清液5毫升25%【W / V ]蔗糖/ TBS洗核颗粒;离心样品(14000×g,25分钟,4°C)。
在260 nm和280 nm为dilutedsample的nucleisuspension 5mL消化液和checkabsorbance比率1.8.resuspend核颗粒;从a260reading近似计算DNA浓度(比ofa260/A280值应为1.1左右)。离心样品(10000转,10分钟,4°C)和悬浮颗粒细胞核at0.5mg/ml in1.7 ml Eppendorf管(S)


2。微球菌核酸酶消化
通常我们添加50 U微球菌核酸酶每0.5毫克的DNA,在1毫升reactionvolume这通常是提供一次成粉;溶解themicrococcal核酸酶所需要的浓度和存储dh20冲在20等分°C.
等分可以重新冻结,再使用一次。这一步需要仔细控制,尤其是在最初的准备。
高浓度的微球菌核酸酶可能在消化thechromatin tosub核小体颗粒,导致。你的目标应该是获得长/中oligonucleosome梯。
如果纯mononucleosome制剂需要进行linearsucrose梯度(5-20%),这将提高分辨率。

2.1。microccal核酸酶消化进行37°C 5分钟。
2.2。用0.2 M EDTA至最终浓度5毫米此外停止反应。
2.3。将所有样品在冰上5分钟;离心样品(8000克,5分钟)。
2.4。拆下并保持第一的S / N(这就是所谓的S1部分;总体积1毫升);储存过夜4°C.
2.5。悬浮颗粒1 ml裂解缓冲液和透析overnightagainst 2升相同的缓冲区。
2.6。经过一夜的透析离心样品(500克,10分钟,4°C)。
2.7。删除和保留上清液(称为S2的总分数;volabout 1.2毫升透析后);在4商店°C.
2.8。重新在200 UL裂解缓冲液不溶性颗粒材料(称为P分数)。
3。水溶性染色质组分分析
3.1。检查所有样品A260/A280比值;S1,S2和pfractions大约有1.7,分别为1.5和1.3。
3.2。1.2%琼脂糖凝胶电泳分析样品。

不要将溴化乙锭的琼脂糖凝胶或electrophoresisbuffer,因为有SDS(见下文)。
3.3。样品的制备:XUL(共5μg(S1,S2)染色质部分和P)尤蒸馏水(x + y = 25ul)3ul 1%【w/v ] SDS(终浓度0.1%)2 ulgel负载缓冲液,含溴酚blue3.4。染色的凝胶with0.5ug/ml溴化乙锭后跑了
4。免疫沉淀
4.1.100-200ug非染色质+ 100-200ul亲和纯化抗体(50-100ug Ig)和最终体积由1.0ml与incubationbuffer。阴性对照,不加抗体,也需要设置为任何nonspecificbinding的染色质的蛋白A琼脂糖凝胶试验。
4.2incubate过夜4°C在缓慢旋转的转台。添加200ul50 % V/V蛋白A琼脂糖凝胶;用尖截止siliconizedpipette让这一步容易。孵育3小时在室温下快速旋转的转盘。
(确保琼脂糖是悬挂在所有时间)。
4.3.centrifuge样品(3000克,10分钟,4,取出保持°C)S / N;这是未绑定的(或“U”)分数。
4.4.resuspend 1ml缓冲层琼脂糖颗粒上相同的缓冲使用硅酮9mlof巴氏吸管和硅化15ml管。
4.5.centrifuge样品(10000克,10分钟,4°C),丢弃的S / N的sepharos andwash。
4.6.finally,悬浮在1毫升缓冲液C和琼脂糖凝胶转移到硅化eppendorfs。
4.7.centrifuge样品(3000克,10分钟,4°C)和悬浮颗粒在1% SDS/thesepharose 250ul bufferand孵化孵化15分钟在室温快速转台。(确保琼脂糖isthoroughly悬浮在所有的时间)。
4.8.centrifuge样品(3000克,10分钟,4、消除及保持°C)/ n;这是绑定的(或“B”)分数。
4.9.wash琼脂糖在250ul 1% SDS/孵化缓冲andcentrifuge立即(3000 g,10 min,4°C)。
拆下的S / N和池与以前的结合部分由过去的一步。
5。DNA的分离
增加缓冲区的每个绑定分数500ul潜伏期,减少sdsconcentration 0.5% SDS。

未绑定和绑定的馏分进行处理如下:

5.1.add 0.33卷(330ul)酚/氯仿;涡旋(13000rpm,10 min,离心)。将有机相界面;这是用于分离免疫沉淀的蛋白质(见下文)。
5.2.transfer以等体积水的上清液(1毫升)酚/氯仿;涡流和旋转(13000转,10min,离心)5.3.transfer上清等体积(1毫升)ofchloroform;涡流和旋转(13000转,10分钟,离心)5.4.transfer S / N到一个干净的离心管,加入0.1vol(100ul)4 M氯化锂,50ug糖原(分子生物学级,溶解于dh20在2毫克/毫升)为载体,乙醇4卷。涡留20屈光°C过夜。
5.5.centrifuge样品(13000克,15分钟)沉淀DNA。
5.6.wash颗粒用70%乙醇使DNA 250ul TE缓冲液。
5.7.tore样品在20 C或进行°检测方法(PCR,微阵列,等)。
5.8.pcr是用来量化的特定位点DNA水平。这种半定量分析(PCR端进行琼脂糖凝胶电泳分析)引物,可以使用下面的URL设计。
DNA水平是通过实时PCR定量测定。probesare经常设计提供引物和实时PCR装置usingsoftware。

6。分离蛋白

6.1.to第一酚/氯仿相(见DNA分离;STEP1)add5ul的1毫克/毫升溶液BSA(作为载体(4UL)),0.01卷10 M H2SO4和丙酮12卷。
6.2.after降水20°C洗蛋白颗粒一旦inacidified丙酮(1:6 100毫米硫酸:丙酮)和3次干燥丙酮。蛋白通过SDS-PAGE分析。

 

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